在抗體藥物開發(fā)過程中，篩選出具有特殊功能和表位的抗體往往面臨一些挑戰(zhàn)。特別是針對一些重要的功能表位，因為免疫系統(tǒng)的免疫優(yōu)勢表位獨占因素，全長蛋白中一些重要的功能域表位不能很好的暴露給免疫細胞，或者免疫原性弱，從而不能有效激活免疫反應(yīng)，導(dǎo)致篩選結(jié)果集中于某些區(qū)域，忽略了其他重要表位。此外，某些復(fù)雜靶點的天然構(gòu)象也可能因單一片段表達而無法完全呈現(xiàn)，進而影響抗體的準(zhǔn)確性和功能。

為了解決這些問題，越來越多的研究開始采用同一靶點的不同蛋白片段（結(jié)構(gòu)域），通過多片段組合策略來更全面地覆蓋靶點表位和功能區(qū)域。這種方法能夠提高篩選的多樣性和準(zhǔn)確性，加速抗體藥物的發(fā)現(xiàn)過程，確保篩選出更具藥物潛力的抗體。

“同一靶點的不同蛋白片段”是指同一個靶點（如受體蛋白、酶或病毒抗原）的多個獨立重組蛋白，這些蛋白來自靶點的不同區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。每個蛋白片段都作為獨立的抗原，用于篩選與其結(jié)合的抗體。

常見的蛋白片段類型包括：

• ECD片段（Extracellular Domain，胞外結(jié)構(gòu)域）：適用于膜蛋白，如細胞因子受體、免疫檢查點等。

• 功能域片段：如配體結(jié)合區(qū)、二聚化界面等功能性區(qū)域。

• 突變體片段與野生型片段：通過突變引入新表位或優(yōu)化抗體結(jié)合位點。

• 近膜端和遠膜端結(jié)構(gòu)域：針對不同的抗體藥分子形式，治療性抗體需要結(jié)合在不同表位達到最佳效果。例如ADC需要抗體可以誘導(dǎo)強內(nèi)化效應(yīng)，很多情況下需要抗體特異性結(jié)合近膜端表位。

每個片段都能呈遞靶點的不同表位或功能位點，增加了抗體篩選的多樣性和準(zhǔn)確性。

如前所述，傳統(tǒng)的單一蛋白片段在抗體篩選中有一定局限，尤其是面對復(fù)雜靶點時。采用多個不同片段可以覆蓋更多表位，提升篩選效率和準(zhǔn)確性，成為解決這些問題的有效策略。在抗體篩選過程中用多個蛋白片段的具體優(yōu)勢如下：

• 擴大抗體多樣性，提高篩選命中率

單一片段蛋白通常只能呈遞靶點的一部分表位，這容易導(dǎo)致抗體篩選過程中只聚焦于某些特定的區(qū)域。而在復(fù)雜的靶點上，不同表位之間可能具有不同的功能作用。因此，單一片段抗原無法全面覆蓋靶點的功能性位點。

采用多個蛋白片段組合的策略，可以覆蓋靶點的不同表位。這不僅能激活多種B細胞反應(yīng)，提高篩選抗體的多樣性，還能夠獲得具有不同功能特性的抗體，如阻斷抗體、激動抗體和調(diào)節(jié)型抗體等。

• 避免抗體篩選中的構(gòu)象誤差

在抗體篩選中，構(gòu)象錯誤或片段偏差可能導(dǎo)致篩選結(jié)果不準(zhǔn)確。單一片段的蛋白可能無法完全展現(xiàn)靶點的天然結(jié)構(gòu)，尤其是那些具有多結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜受體。當(dāng)我們使用多個片段時，可以確保不同片段展示靶點的多樣性，從而避免因片段錯誤折疊而篩選到假陽性抗體。

此外，通過多片段抗原篩選出的抗體，其結(jié)合的表位和功能位點更接近靶點的天然狀態(tài)，因此具有更高的藥物化潛力。

• 提高篩選效率，縮短開發(fā)周期

使用多個蛋白片段可以顯著提高篩選效率。傳統(tǒng)的抗體篩選通常需要多輪免疫和篩選，每輪都依賴于不同的抗原組合。通過使用多片段抗原，研究人員可以在免疫階段就通過不同片段的混合免疫覆蓋多個表位，避免了反復(fù)免疫和篩選的步驟，極大地提高了篩選的效率。

此外，在panning和二篩階段，使用多個片段抗原還可以確保篩選的抗體針對多個表位，避免抗體對特定片段的依賴。

• 開發(fā)雙表位識別雙抗分子

針對一些容易產(chǎn)生免疫逃逸或者突變表位的蛋白靶點，開發(fā)雙表位雙抗有特殊意義，目前也有多個成功案例。例如已經(jīng)獲批上市的針對BCMA靶點的雙表位結(jié)合CARVYKTI?。

蛋白片段在抗體篩選中扮演著關(guān)鍵角色。通過使用多個不同片段，能夠全面覆蓋靶點表位，提高抗體的多樣性、特異性和功能性，優(yōu)化免疫、篩選及驗證階段的效果，顯著加速抗體篩選過程。

• 免疫階段：提高免疫原性

在抗體的免疫階段，使用多個蛋白片段可以激活多種B細胞反應(yīng)，提升抗體的免疫原性。當(dāng)多個片段同時用于免疫時，不同的B細胞亞群會識別不同的抗原區(qū)域，從而形成多譜系的抗體反應(yīng)。這種多樣性有助于篩選出對靶點不同功能區(qū)域具有反應(yīng)的抗體，而不是僅僅針對單一區(qū)域。

• Display篩選階段：優(yōu)化篩選過程

在Phage Display、Yeast Display等抗體篩選技術(shù)中，使用多個蛋白片段抗原可以有效提高篩選的特異性和敏感性。通過輪換使用不同片段進行panning，可以提高篩選的準(zhǔn)確性，并防止篩選到僅與某個特定片段結(jié)合的抗體。

• 二篩驗證階段：片段交叉驗證

在抗體的二篩和親和力測定階段，使用不同片段抗原進行交叉驗證是非常關(guān)鍵的。這能夠幫助確認抗體是否真正結(jié)合靶點的功能性區(qū)域，而不是僅僅與標(biāo)簽或非特異性區(qū)域結(jié)合。多片段抗原的使用能夠提供更為準(zhǔn)確的表位確認，確保篩選出的抗體具有較高的功能性。

多片段蛋白策略在抗體篩選中廣泛應(yīng)用于復(fù)雜靶點，如多域受體、GPCR和病毒抗原等。通過覆蓋多個功能區(qū)域，這種方法能夠提高篩選效果，增強抗體的多樣性和特異性，適應(yīng)不同靶點的需求。

• 多域受體蛋白（如EGFR、HER2等）

許多受體蛋白，特別是那些涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多結(jié)構(gòu)域蛋白，具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多個功能性表位。通過使用多個蛋白片段，研究人員可以在篩選過程中全面覆蓋這些表位，從而發(fā)現(xiàn)具有藥物潛力的抗體。尤其是在針對HER2、EGFR等靶點時，多片段抗原能夠提高抗體對這些關(guān)鍵表位的識別率。

• GPCR和TNFR家族靶點

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）和腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族成員是藥物開發(fā)中的重要靶點，它們的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且具有多個結(jié)合位點。在這些靶點的抗體篩選中，使用多片段抗原能夠有效避免篩選到與非功能性區(qū)域結(jié)合的抗體，提高篩選結(jié)果的可靠性。

• 病毒抗原（如 SARS-CoV-2 Spike）

對于病毒抗原，如SARS-CoV-2的Spike蛋白，使用不同的蛋白片段進行篩選可以更全面地覆蓋病毒表面不同的結(jié)合位點。通過多片段策略，可以提高篩選出中和抗體的概率，尤其是在疫苗和抗病毒治療研發(fā)中，具有重要意義。

多片段蛋白的制備不僅需要精準(zhǔn)的設(shè)計，還要求高效的表達和嚴(yán)格的質(zhì)量控制。特別是當(dāng)涉及復(fù)雜的靶點時，確保每個片段的正確折疊和功能性至關(guān)重要。傳統(tǒng)的重組蛋白表達系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母和昆蟲）有時難以滿足高質(zhì)量、多片段抗原的生產(chǎn)需求。因此，采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)成為了許多生物制藥公司解決這一問題的理想選擇。

締碼生物利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)已成功制備了多個熱門藥物靶點（見下表）的多片段蛋白，確保了蛋白的高效表達和結(jié)構(gòu)的正確折疊。這些蛋白片段不僅在抗體篩選中展現(xiàn)了優(yōu)異的性能，還能更好地保持靶點的天然構(gòu)象和功能性，大大提高了抗體篩選的精確度和效率。