1. CAR陽性率檢測

在CAR-T細(xì)胞治療日益成熟的今天，如何準(zhǔn)確評估CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)水平，已成為臨床前質(zhì)控、放行標(biāo)準(zhǔn)以及療效預(yù)測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，“CAR陽性率”（%CAR?）作為最直觀的指標(biāo)，通常通過流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等手段檢測CAR對其靶抗原的結(jié)合能力。

為了準(zhǔn)確檢測 CAR 在細(xì)胞表面的表達(dá)情況，研究人員目前常采用以下幾種類型的試劑，各有其特點(diǎn)與適用場景。

• Protein L

Protein L是一種常用的通用性檢測試劑，能夠與抗體的κ輕鏈結(jié)合。它可檢測多種不同靶點(diǎn)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞，操作簡便，適配性較強(qiáng)。然而，其識別范圍有限，僅能識別人源VκⅠ、VκⅢ和VκⅣ亞型以及鼠源VκⅠ亞型，無法識別VκⅡ亞型和大部分鼠源Ig的其他亞型輕鏈，因此在某些構(gòu)建背景下存在檢測盲區(qū)。

• Anti-Fab抗體

lAnti-Fab抗體能夠識別抗體Fab區(qū)域，具備一定的通用性，也常用于檢測不同靶點(diǎn)的CAR構(gòu)建。然而，這類試劑通常來源于多克隆抗體，導(dǎo)致背景值較高、批間差異性大，且商品化產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，影響數(shù)據(jù)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

• Anti-idiotype抗體

Anti-idiotype抗體是一種高度特異性的工具，可直接識別scFv結(jié)構(gòu)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這類抗體具備高特異性、高靈敏度、低背景等優(yōu)點(diǎn)，是CAR特異性檢測的理想選擇。但受限于其高度專屬性，市售產(chǎn)品稀缺，往往需要定制開發(fā)，周期較長（一般為6個月左右），不適用于快速篩查或標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控流程。

• 靶點(diǎn)蛋白

l靶點(diǎn)蛋白作為檢測工具也是常用策略之一。該方法依賴CAR結(jié)構(gòu)中scFv與目標(biāo)抗原的結(jié)合特性，因而具備良好的靶點(diǎn)專屬性，可在一定程度上評估CAR與靶標(biāo)的功能性結(jié)合能力。但其檢測靈敏度會受到scFv與靶蛋白之間親和力的顯著影響，若親和力較弱，可能導(dǎo)致信號不強(qiáng)或假陰性。此外，靶點(diǎn)蛋白的純度、構(gòu)象是否正確等因素也直接影響檢測結(jié)果。

然而，檢測的準(zhǔn)確性高度依賴于所用抗原蛋白的結(jié)構(gòu)完整性與構(gòu)象保真度。目前常用的靶抗原檢測材料主要包括：

• 可溶蛋白片段：如胞外區(qū)Fc融合蛋白，結(jié)構(gòu)不完整、構(gòu)象不穩(wěn)定；

• 細(xì)胞系或細(xì)胞膜表達(dá)系統(tǒng)：批次差異大、背景信號高、操作復(fù)雜；

• MSP納米盤重構(gòu)膜蛋白：需共組裝脂質(zhì)，構(gòu)建步驟繁瑣，受脂組影響較大。

在此背景下，如何以簡便、穩(wěn)定的方式展示天然構(gòu)象的跨膜蛋白，成為CAR陽性率檢測的突破點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)更真實(shí)、穩(wěn)定且高通量的CAR陽性率評估，亟需一種能夠精準(zhǔn)重現(xiàn)靶抗原天然構(gòu)象、簡化操作流程、降低檢測背景的新型工具。PeptiNanodisc平臺應(yīng)運(yùn)而生，以其獨(dú)特的短肽自組裝機(jī)制，為跨膜蛋白在CAR檢測中的展示提供了全新解決方案。

2. PeptiNanodisc&CAR陽性率檢測

PeptiNanodisc 是一種基于短肽自組裝的膜蛋白重構(gòu)平臺，由兩段人工設(shè)計的 amphipathic α-肽包裹目標(biāo)膜蛋白形成納米盤，無需添加脂質(zhì)或膜支撐蛋白。該技術(shù)可穩(wěn)定重構(gòu)多類膜蛋白，尤其適合呈現(xiàn)天然構(gòu)象的跨膜靶點(diǎn)，用于 CAR-T 細(xì)胞檢測等功能研究。

2.1 什么是PeptiNanodisc？

PeptiNanodisc，是利用特殊肽段包裹住膜蛋白的疏水部分（類似于肽盤），從而保護(hù)其不受水溶液的影響。由于不存在磷脂和去垢劑，利用PeptiNanodisc平臺表達(dá)出的膜蛋白可以用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。而且，理論上肽盤可以像‘通用支架’一樣，適用于各種膜蛋白，不受蛋白大小限制。該技術(shù)可穩(wěn)定重構(gòu)多類膜蛋白，尤其適合呈現(xiàn)天然構(gòu)象的跨膜靶點(diǎn)，用于 CAR-T 細(xì)胞檢測等功能研究。

Fig 1. Assembly of PeptiNanodisc.

2.2 PeptiNanodisc優(yōu)勢

在CAR-T檢測體系中，一個優(yōu)秀的靶抗原材料必須滿足三大核心標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)構(gòu)真實(shí)、檢測穩(wěn)定、適配性強(qiáng)。PeptiNanodisc 正是在這三方面同時實(shí)現(xiàn)突破，為CAR陽性率檢測帶來了多個關(guān)鍵優(yōu)勢：

2.2.1 真實(shí)構(gòu)象還原 —— 展示完整的跨膜結(jié)構(gòu)

PeptiNanodisc無需額外脂質(zhì)或膜支撐蛋白，即可將靶抗原重構(gòu)成穩(wěn)定的類原生構(gòu)象狀態(tài)。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膜蛋白，PeptiNanodisc 能保留其跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)域之間的空間關(guān)系，最大程度還原其在細(xì)胞膜上的三維狀態(tài)。這意味著CAR分子識別的不再是“蛋白碎片”，而是完整靶標(biāo)，就像它在腫瘤細(xì)胞表面那樣。這種原始構(gòu)象的展示，大幅提升了CAR與其目標(biāo)結(jié)合的親和力與特異性，從而提高檢測陽性率，降低假陰性風(fēng)險。

2.2.2 高穩(wěn)定性與重復(fù)性 —— 提升信號一致性、降低背景干擾

傳統(tǒng)的融合蛋白在體外環(huán)境中極易發(fā)生聚集、變性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)間重復(fù)性差。而PeptiNanodisc重構(gòu)后的抗原具有良好的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)一致性，在多種檢測條件下（如37°C孵育、4°C儲存、凍融）都表現(xiàn)出出色的抗性。

此外，PeptiNanodisc 中無脂質(zhì)背景，無Fc區(qū)、無非特異性標(biāo)簽，不易引發(fā)抗體的背景結(jié)合，有效提升流式和ELISA等免疫檢測平臺的信噪比，讓結(jié)果更清晰、判讀更可靠。

2.2.3 高通量兼容性 —— 適配多種檢測平臺與標(biāo)簽系統(tǒng)

PeptiNanodisc 構(gòu)建靈活，支持多種標(biāo)簽（如Strep、FLAG）以及多樣化功能修飾（如熒光標(biāo)記、biotin標(biāo)記等），可廣泛應(yīng)用于以下檢測方式：

• 流式細(xì)胞術(shù)：將抗原偶聯(lián)熒光標(biāo)記，用于識別CAR陽性細(xì)胞；
• ELISA功能驗(yàn)證：板面包被抗原，檢測CAR抗體/結(jié)構(gòu)體的結(jié)合活性；

此外，其標(biāo)準(zhǔn)化純化流程及良好的可溶性，適合大批量生產(chǎn)及自動化檢測平臺的對接，利于質(zhì)控流程標(biāo)準(zhǔn)化。

2.2.4 更高批次一致性與合成效率 —— 為商業(yè)化檢測提供保障

PeptiNanodisc 核心成分為人工合成的短肽，來源清晰、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不依賴細(xì)胞表達(dá)或天然蛋白提取，極大降低批間差異與制備難度。這種“合成可控”的構(gòu)建方式，特別適合：

• 高標(biāo)準(zhǔn)CAR-T生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的放行檢測；
• 多中心臨床樣本中統(tǒng)一方法驗(yàn)證；
• 新CAR靶點(diǎn)研發(fā)早期的功能篩選與結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

PeptiNanodisc真正解決了“怎么讓CAR識別到正確的抗原”這一核心難題。它讓CAR-T檢測從“看得見”走向“看得準(zhǔn)”，為CAR產(chǎn)品質(zhì)控與結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了更真實(shí)、更穩(wěn)定、更可靠的技術(shù)支撐。

3. 締碼PeptiNanodisc案例展示

• CAR陽性率檢測

① 未標(biāo)記PeptiNanodisc檢測CAR陽性率

采用流式細(xì)胞術(shù)，分別用GPRC5D PeptiNanodisc (FLP400011)和G4S-PE蛋白來檢測GPRC5D CAR細(xì)胞陽性率。

結(jié)果表明：GPRC5D PeptiNanodisc (FLP400011)檢測GPRC5D CAR陽性率與G4S-PE檢測方法效果相當(dāng)。

② 熒光標(biāo)記PeptiNanodisc檢測CAR陽性率

采用流式細(xì)胞術(shù)，分別用FITC標(biāo)記CLDN18.2 peptiNanodisc和G4S-PE蛋白來檢測CLDN18.2 CAR細(xì)胞陽性率。

結(jié)果顯示：FITC標(biāo)記CLDN18.2 peptiNanodisc檢測CLDN18.2 CAR陽性率與G4S-PE方法檢測結(jié)果相當(dāng)，且無需熒光二抗，操作更方便。

• SDS-PAGE&ELISA驗(yàn)證

經(jīng)SDS-PAGE 和ELISA驗(yàn)證，peptiNanodisc蛋白表現(xiàn)出高純度及良好的抗體結(jié)合活性。

• 凍干及保存穩(wěn)定性檢測

采用ELISA和SDS-PAGE檢測不同條件下的PeptiNanodisc，結(jié)果顯示其具有良好穩(wěn)定性及結(jié)合活性。

ELISA分別檢測液體狀態(tài)和凍干粉狀態(tài)下GPRC5D PeptiNanodisc與GPRC5D抗體結(jié)合活性（左）；ELISA檢測GPRC5D PeptiNanodisc分別在-20℃、37℃ 24h、37℃ 48h、37℃ 72h條件下，其與GPRC5D抗體結(jié)合活性（中）；SDS-PAGE分析不同條件下：-80℃液體狀態(tài)、-20℃凍干粉狀態(tài)及凍干粉狀態(tài)37℃分別放置24h、48h、72h的GPRC5D PeptiNanodisc（右）

• 締碼PeptiNanodisc部分產(chǎn)品列表

產(chǎn)品貨號	產(chǎn)品名稱
FLP400011	Human?GPRC5D?full?length?protein-PeptiNanodisc
FLP420008	Human?CLDN6-Strep?full?length?protein-PeptiNanodisc
FLP420014	Human?CLDN18.2-Strep?full?length?protein-PeptiNanodisc