膜蛋白是維持細(xì)胞生理過程最重要的組成部分，在物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間識別等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用，人類基因組中編碼的膜蛋白約占總蛋白質(zhì)組的25%。目前膜蛋白藥物靶點(diǎn)占現(xiàn)階段己知藥物靶點(diǎn)的60%以上，而抗體藥靶點(diǎn)中膜蛋白占90%以上，例如 BCMA、GPRC5D、CCR8 [1]。 盡管膜蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但他們的制備是極具挑戰(zhàn)性的，尤其是多次跨膜蛋白。多跨膜蛋白具有兩個或兩個以上跨膜區(qū)，可以依靠自身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)進(jìn)行形變，并通過結(jié)構(gòu)的改變來完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 由于存在跨膜區(qū)的疏水結(jié)構(gòu)域，在體外容易聚合，使得其在體外難以保持其正確的天然空間構(gòu)象，從而影響蛋白的正常功能。因此如何讓膜蛋白在體外仍保持其天然構(gòu)象，是膜蛋白表達(dá)純化過程中面臨的重要問題。另外如何提高蛋白純度，也是需要解決的問題之一。締碼獨(dú)創(chuàng)的DiMPro?合成納米圓盤（Synthetic Nanodisc）為為這些多穿膜蛋白提供了一個可行的解決方案。
1、什么是Nanodisc？
Nanodisc中文名稱為納米磷脂盤或納米圓盤，其概念最早由伊利諾伊大學(xué)的Stephen G. Sligar教授于2002年提出。
20世紀(jì)90年代末，Sligar教授在為原子力顯微鏡(AFM)結(jié)構(gòu)研究尋找優(yōu)秀候選者時，因受到同校Ana Jonas教授研究的啟發(fā)而提出了Nanodiscs可作為研究膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能有力工具。Ana Jonas教授的研究重點(diǎn)是動脈粥樣硬化過程中高密度脂蛋白 (HDL) 的主要循環(huán)形式。她發(fā)現(xiàn)這些形式通常以不同大小的球體形式存在，含有膽固醇酯、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。此外，她還發(fā)現(xiàn)了一種短暫形式的HDL，其形狀大致呈盤狀，并由兩親性載脂蛋白 A-I (Apo-AI) 穩(wěn)定。
受到 Jonas 教授工作的啟發(fā)，Sligar教授團(tuán)隊通過從富含脂質(zhì)的 Apo-AI 組分（從人體血液中分離獲得）中去除去污劑，重建了更大的HDL顆粒，并將這些HDL顆粒在原子扁平云母上成像 [2] [3]。 他們發(fā)現(xiàn)這些顆粒極其異質(zhì)，尺寸分布的峰值對應(yīng)于重復(fù)Apo-AI 蛋白的長度，這表明這些顆粒通常存在一個特定的尺寸范圍 [4]。為了制造尺寸均勻的納米顆粒，Sligar教授合成了可在大腸桿菌中表達(dá)的重組Apo-AI 編碼序列，并修改了重塑程序。 通過這種基因工程和重塑過程，研究人員成功生產(chǎn)了一組稱為“膜支架蛋白”(MSP)的蛋白質(zhì)，它們可以自組裝成稱為Nanodiscs的盤狀磷脂雙層。這些納米圓盤被磷脂烷基鏈周圍的兩親性螺旋帶包裹，可以模擬膜蛋白的自然環(huán)境，并為其分析提供穩(wěn)定的平臺 [5]。自推出以來，納米圓盤徹底改變了膜蛋白研究領(lǐng)域，并成為藥物發(fā)現(xiàn)和遞送的寶貴工具。 它們的小尺寸、穩(wěn)定性和模仿細(xì)胞膜的能力使它們成為提供治療的理想載體。
2、Nanodisc的優(yōu)勢有哪些？
除了Nanodisc之外，制備功能性多次跨膜蛋白還有很多解決方案，包括去垢劑、胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）、膜組分、全細(xì)胞和VLP 等[6]。其中，去垢劑應(yīng)用最廣。但是，使用去垢劑最大缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)需要保留在含有去垢劑的溶液中，并且去垢劑不能完全去除。這會對蛋白質(zhì)結(jié)合和下游實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。
選擇表達(dá)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域（ECD）雖然可以獲得可溶性、正確折疊的蛋白質(zhì)，但是，獲得的產(chǎn)物與多次跨膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)和構(gòu)象是不一樣的。膜組分、全細(xì)胞和VLP方案雖然能維持多次跨膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)，但組分比較復(fù)雜，用其得到的蛋白進(jìn)行免疫會產(chǎn)生高水平的非特異性抗體。與這些方案相比，Nanodisc利用具有疏水和親水雙重特性的物質(zhì)作為穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑朝向內(nèi)部脂層的疏水面可將膜蛋白整合到Nanodisc中，維持膜蛋白的天然空間構(gòu)象和活性。同時，朝外的親水面使得Nanodisc在水溶液中具有很高的溶解度和穩(wěn)定性。通過nanodisc獲得的蛋白不含去垢劑，適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
3、Nanodisc類型有哪些？
根據(jù)穩(wěn)定劑的不同，可將Nanodisc分為不同類型: MSP nanodisc和 Synthetic nanodisc.
Figure 1. The structure of MSP-Nanodisc (left) and Synthetic Nanodisc (right)
3.1 MSP nanodisc
MSP nanodisc使用Membrane scaffold proteins（MSPs）作為穩(wěn)定劑，包裹人工磷脂成分和跨膜蛋白，形成一個納米圓盤。所形成的納米圓盤的大小由所選用的MSPs決定，一般直徑范圍為7至13nm。 Nanodisc組裝中常用的MSP，包括MSP1D1、MSP1D1-DH5和MSP1E3D1。 這些 MSP 已被廣泛研究并證明可有效生成穩(wěn)定且功能性的 Nanodisc 蛋白。其制備過程通常有兩種形式：
- 組裝溶解在去垢劑中的膜蛋白
在去垢劑存在的條件下將膜蛋白純化，然后添加MSPs和磷脂。膜蛋白、MSPs和磷脂能夠自發(fā)地組裝成為nanodisc，去除掉去垢劑后可以通過尺寸排阻色譜或親和純化等方式來純化。下圖以A2AR蛋白為例，闡述具體過程。
Figure 2. Assembly of MSP-Nanodisc [7]
- Nanodisc與無細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合
將組裝好的納米圓盤加入到無細(xì)胞反應(yīng)體系中。從表達(dá)質(zhì)粒開始，膜蛋白可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生并自發(fā)整合到納米圓盤中。
3.2 Synthetic Nanodisc
與 MSP Nanodisc不同，Synthetic Nanodisc（合成納米盤）是用合成聚合物生產(chǎn)的，通常包括苯乙烯-馬來酸共聚物 (SMA) 和二異丁烯-馬來酸 (DIBMA)。 每種聚合物都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，DIBMA不吸收280 nm的光，這使其成為涉及使用光譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的實(shí)驗(yàn)的理想選擇。
合成納米盤的組裝起始于完整的細(xì)胞。它利用合成的聚合物溶解細(xì)胞膜，同時利用原生細(xì)胞磷脂在膜蛋白周圍形成納米盤結(jié)構(gòu)。聚合物同時作為增溶劑和穩(wěn)定劑。因此，不需要額外的去垢劑。
Figure 3. Assembly of Synthetic Nanodisc
4、如何選擇合適的nanodisc？
MSP和Synthetic Nanodisc蛋白都實(shí)現(xiàn)膜蛋白的溶解和穩(wěn)定。 但二者之間存在明顯差異。
| MSP Nanodisc Protein | Synthetic Nanodisc Protein | |
| 穩(wěn)定劑 | MSP | Polymer |
| 大小 | 7-17nm | Around 10nm |
| 磷脂組分 | Artificial phospholipid environments | Native cell membrane lipids |
| 磷脂來源 | Proteins obtained from Cell-free reaction or detergent-solubilized method | Directly from the cells |
| 是否需要去垢劑 | May use detergent during protein preparation | No detergent |
MSP Nanodisc蛋白質(zhì)因其尺寸均勻而成為Cryo-EM等應(yīng)用的完美工具。但因 MSP蛋白分子量大，它的存在會對目的蛋白產(chǎn)生干擾，而且在280nm處的吸光度無法輕松確定MSP Nanodisc蛋白質(zhì)溶液中目標(biāo)蛋白的量。此外，對于，由于去垢劑參與MSP Nanodisc蛋白制備過程中的細(xì)胞膜溶解，因此需要選擇不干擾目標(biāo)蛋白折疊的去垢劑。 但是，在Synthetic Nanodisc蛋白質(zhì)中，聚合物既充當(dāng)增溶劑又充當(dāng)穩(wěn)定劑，因此不需要洗滌劑。基于Synthetic Nanodisc蛋白的優(yōu)勢，締碼生物為全長多次跨膜蛋白開發(fā)了基于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的創(chuàng)新性合成納米圓盤平臺。
5、為何選擇哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)制備Nanodisc 蛋白？
締碼所有Nanodisc蛋白均由哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備，我們?yōu)楹螘x擇哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)呢？
首先，眾所周知，哺乳動物細(xì)胞能夠使蛋白質(zhì)正確折疊并提供翻譯后修飾，確保所得的Nanodisc蛋白質(zhì)與其天然對應(yīng)物非常相似。 這對于結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)等應(yīng)用非常重要，而且，蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)對其功能至關(guān)重要。
其次，哺乳動物細(xì)胞為復(fù)雜和多次跨膜蛋白提供了有利的環(huán)境。這些類型的蛋白質(zhì)通常需要特定的分子伴侶和輔助因子才能正確折疊和組裝，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，這在哺乳動物細(xì)胞中更容易實(shí)現(xiàn)。這確保了所得的Nanodisc蛋白的功能和穩(wěn)定性。
此外，哺乳動物細(xì)胞的使用允許摻入翻譯后修飾，例如糖基化，這對于許多蛋白質(zhì)的生物活性很重要。這些修飾可以影響 Nanodisc 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，使哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)成為生產(chǎn)生物學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)的首選。
總體而言，在 DIMA 生產(chǎn) Nanodisc 蛋白時使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)可確保蛋白在結(jié)構(gòu)、功能和翻譯后修飾方面與天然對應(yīng)物非常相似，使其成為生物化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的理想工具。
Comparison of different expression hosts
| Expression Host | Pros | Cons | Recommend Usage |
| E.coli | EconomicFast | Inclusion bodies Not for large proteinNo PTMs | Bacterial proteinSmall proteins such as cytokine and enzyme |
| Yeast | FastLimited PTMs | No γ-carboxylationN-glycosylation focuses on Mannose. | Small proteins such as cytokine and enzyme |
| Baculovirus | FastLimited PTMs | No γ-carboxylationN-glycosylation is very simple without sialic acid. | secretory proteincytoplasmic proteintoxic protein. |
| Mammalian | diverse PTMsGood solubility | Low yield | Complex MPsRecombinant Antibody et al. |
6、締碼Synthetic Nanodisc
DiMPro?合成納米圓盤是一種多次跨膜蛋白的創(chuàng)新性解決方案，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
- 高純度全長膜蛋白
- 溶解度高
- 穩(wěn)定性高，凍干粉常溫下穩(wěn)定
- 蛋白質(zhì)處于天然膜環(huán)境中并保持生物活性
- 無需去垢劑，適用于細(xì)胞分析
- 無MSP骨架蛋白
該技術(shù)制備的多次跨膜蛋白可用于各種應(yīng)用，包括 ELISA、SPR 親和分析、噬菌體展示篩選、免疫、基于細(xì)胞的測定和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析等。
7、案例展示
Human MDR-1 full length protein-synthetic nanodisc (FLP100029) 12 transmembrane protein
Figure 4. MDR-1-synthetic nanodisc validated data. (Left) Human MDR-1-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE; (Right) MDR-1-Nanodisc (FLP100029) can bind anti-Flag monoclonal antibody and the EC50 is 6.883ng/ml.
Human GPRC5D full length protein-synthetic nanodisc ( FLP100011) 7 transmembrane protein
Figure 5. GPRC5D-synthetic nanodisc validated data. (Left) Human GPRC5D-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE; (Right) GPRC5D-Nanodisc (FLP100011) can bind anti-GPRC5D mAb (DME100090) and the EC50 is 32.86ng/ml.
Human CLDN6 full length protein-synthetic nanodisc (Cat. FLP100008) 4 transmembrane protein
Figure 6. CLDN6-synthetic nanodisc validated data. (Left) Human CLDN6-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE; (Right) CLDN6-Nanodisc (FLP100008) can bind anti-CLDN6 mAb (BME100082) and the EC50 is 66.99ng/ml.
參考文獻(xiàn):
[1]Denisov, I., Sligar, S. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol 23, 481–486 (2016).
[2] Jonas A, Kezdy KE, Wald JH. Defined apolipoprotein A-I conformations in reconstituted high density lipoprotein discs. J Biol Chem. 1989;264:4818–4824.
[3]Wald JH, Krul ES, Jonas A. Structure of apolipoprotein A-I in three homogeneous, reconstituted high density lipoprotein particles. J Biol Chem. 1990;265:20037–20043.
[4]Carlson JW, Jonas A, Sligar SG. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys J. 1997;73:1184–1189.
[5]Schuler MA, Denisov IG, Sligar SG. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 2013;974:415-33.
[6]Jo M, Jung ST. Engineering therapeutic antibodies targeting G-protein-coupled receptors. Exp Mol Med. 2016 Feb 5;48(2):e207.
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