癌胚蛋白5T4又稱Wnt 激活抑制因子 1（WAIF1）、滋養(yǎng)層細胞糖蛋白（TPBG），是一種存在于胚胎滋養(yǎng)層細胞中的糖蛋白。因在成人正常組織中表達受限，但在許多實體瘤惡性腫瘤中高表達而被選為實體瘤靶點。據(jù)Clinical trial數(shù)據(jù)統(tǒng)計，目前5T4在研藥物差不多9種，臨床管線也才近20條，但其藥物類型比較多樣，涉及腫瘤疫苗、融合蛋白、ADC、雙抗、CAR-NK。其中，腫瘤疫苗（Trovax）和融合蛋白（Naptumomab estafenatox）進展最快，目前最高研發(fā)狀態(tài)處于臨床II期。解鎖多條生物藥類型的5T4究竟是什么？目前各類型藥物的進展又是如何？一文帶您了解全部詳情。

1、5T4的結(jié)構(gòu)及表達

5T4是由TPBG基因編碼的脊椎動物特異性單次跨膜蛋白，編碼蛋白的基因位于染色體6q14-15上。5T4蛋白是N端高度糖基化的跨膜蛋白，首次在人胎盤組織中發(fā)現(xiàn) ^[1]。人類5T4全長蛋白的分子量約為72kDa，蛋白序列保守，由420個氨基酸組成。5T4蛋白在胞外結(jié)構(gòu)域中包含一個細胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)（356-376aa）和一個胞內(nèi)區(qū)(如Figure 1所示）^[2][3]。細胞外區(qū)含有多個富含亮氨酸的重復(fù)序列 (LRR)和7個N糖基化位點。LRR區(qū)參與蛋白質(zhì)間互作，糖基化位點結(jié)構(gòu)多樣，能夠防止蛋白質(zhì)水解。胞內(nèi)區(qū)含有PDZ結(jié)合基序（Ser-Asp-Val），該結(jié)合基序可以與TIP-2/GIPC互相作用。TIP-2/GIPC是一種與位于細胞附近的囊泡相關(guān)的細胞質(zhì)蛋白膜。與TIP-2/GIPC互相作用可參與細胞遷移和黏附信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)控。

Figure 1. The structure of 5T4 [4]

5T4在正常成人組織中很少表達，但廣泛表達于胚胎發(fā)育期的各滋養(yǎng)層細胞和大多數(shù)常見腫瘤中。在約80%的腎癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和卵巢癌中高表達。

2、5T4的信號通路

由于5T4在正常組織和癌癥組織中的差異化表達，所以5T4可作為具有潛在治療價值的腫瘤治療靶點。但目前對該分子在腫瘤中的作用機制了解仍然很少。但現(xiàn)存研究表明5T4可能是通過Wnt信號通路、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和CXCR4/CXCL12通路發(fā)揮作用。

2.1 5T4與Wnt信號通路

Wnt信號通路是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵通路，對個體的正常發(fā)育、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和再生至關(guān)重要。Wnt有兩條途徑，Wnt/β-catenin經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。Wnt/β-catenin經(jīng)典途徑的關(guān)鍵是粘附連接相關(guān)蛋白β-catenin向細胞核的積累和易位。而Wnt非經(jīng)典途徑又稱平面細胞極性(PCP)途徑，是Wnt配體與Frizzled受體或其共受體結(jié)合從而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)。Wnt信號通路在正常成熟細胞中處于未激活狀態(tài)，但在腫瘤細胞中活性增強。

研究已證實，5T4會干擾 Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)并同時激活非經(jīng)典Wnt通路，對Wnt信號通路具有雙重調(diào)節(jié)。5T4與Wnt共受體LRP6結(jié)合并抑制其與Wnt受體的內(nèi)吞，從而阻斷Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路，繼而抑制細胞黏附和細胞骨架的形成，促進腫瘤遷移和擴撒。此外，5T4通過活化DKK1來激活非經(jīng)典Wnt通路，促進細胞遷移和浸潤 ^[5]。

Figure 2. Model of Waif1a function as modifier of Wnt signaling pathways [5]

2.2 上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，它賦予細胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。有研究表明5T4被是小鼠和人胚胎干細胞早期分化的標志物，該過程涉及多個EMT經(jīng)典特征，包括E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)換、E-cadherin抑制分子（如Snail和Slug蛋白）的上調(diào)及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2和MMP-9）活性增強 ^{[6] [7] [8]}。

2.3 CXCR4/CXCL12通路

CXCL12和CXCR4表達都與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)。而且有研究表明CXCR4的表達有助于癌癥擴散到CXCL12高表達的組織中，比如肺、肝、淋巴結(jié)和骨髓 ^{[9] [10]}。5T4被證實參與一些胚胎和腫瘤細胞表面CXCR4的功能表達，可通過CXCR4/CXCL12通路，促進腫瘤細胞的趨化轉(zhuǎn)移 ^{[11] [12]}。

3、5T4的臨床進展

目前全球并未有針對5T4的靶向藥上市，最高的研發(fā)狀態(tài)是Phase II。據(jù)Clinical trial數(shù)據(jù)統(tǒng)計，目前有9個藥物處于臨床階段，其中有5款藥物處于Phase II，4款處于Phase I（有一款在Early Phase I）。

3.1 處于II期臨床的藥物

Ankara-5T4 vaccine（疫苗）是由SWOG Cancer Research Network開發(fā)的癌癥疫苗，針對適應(yīng)癥為乳腺癌，最高臨床階段為Phase II，目前關(guān)于其在臨床上的效果報道較少。

TroVax（疫苗），又稱為MAV-5T4，是改良版的Ankara-5T4 vaccine，由英國Oxford BioMedica公司開發(fā)的癌癥疫苗。TroVax是減毒修飾牛痘病毒安卡拉，經(jīng)過改造后編碼人類5T4抗原，通過刺激機體產(chǎn)生抗5T4的免疫應(yīng)答來殺傷癌細胞。目前臨床上已針對多種適應(yīng)癥展開臨床試驗，涉及腸癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌和間皮瘤。臨床上的給藥方式也涉及多種，包括單藥和聯(lián)用。其中聯(lián)用又涉及與IL-2、Nivolumab（PD-1）或GM-CSF聯(lián)用。2017年發(fā)表的一項隨機臨床試驗數(shù)據(jù)表明，在本次試驗納入的55名不可手術(shù)且在標準化療后病情穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，其中9名患者僅接受環(huán)磷酰胺治療、19名患者僅接受MVA-5T4治療及18名患者接受MVA-5T4和環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥治療。結(jié)果顯示MVA-5T4和聯(lián)合治療組的5T4特異性抗體免疫反應(yīng)顯著增強，延長患者OS/PFS（20/10.3月 vs 5.6/2.4月）^[13]。

Naptumomab estafenatox（NAP）（重組蛋白）是由NeoTX Therapeutics開發(fā)的融合蛋白，由一個識別5T4的抗原結(jié)合片段（Fab）與一種金黃色葡萄球菌腸毒素A（SEA/E-120）的突變形態(tài)（estafenatox）組成。Sag部分選擇性地與T細胞受體β變量 (TRBV) 7-9 結(jié)合。T細胞通過直接殺傷、分泌細胞因子清除腫瘤細胞。目前，最高研發(fā)狀態(tài)為Phase II，針對的適應(yīng)癥為非小細胞肺癌、腎癌和胰腺癌。2016年發(fā)表的一項關(guān)于NAP與IFNα聯(lián)合用藥治療腎細胞癌的臨床II/III期試驗結(jié)果表明，這項II/III期研究未達到其主要終點。NAP+IFN患者的中位OS/PFS為17.1/5.8個月，而單獨接受IFN的患者為 17.5/5.8 個月，NAP聯(lián)合IFNα用藥的安全性在可接受范圍內(nèi) ^[14]。

ALG.APV-527（雙抗）是由Aptevo Therapeutics和Alligator Bioscience AB聯(lián)合開發(fā)的雙特異性抗體，同時靶向4-1BB和5T4，擬開發(fā)適應(yīng)癥為實體瘤。目前最高的研發(fā)狀態(tài)為Phase II。ALG.APV-527臨床前數(shù)據(jù)顯示，ALG.APV-527具有在不刺激身體其他部位免疫系統(tǒng)的情況下，選擇性加強腫瘤中T細胞反應(yīng)潛力。

GEN1044（雙抗）是由Genmab和AbbVie聯(lián)合開發(fā)的雙特異性抗體，同時靶向人T細胞表面抗原CD3和癌胎抗原5T4，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。當前最高研發(fā)狀態(tài)為Phase II，針對的適應(yīng)癥是實體瘤，但相關(guān)臨床數(shù)據(jù)暫未披露。

3.2 處于I期臨床的藥物

ASN004（ADC）是由Kirilys Therapeutics公司開發(fā)的靶向癌胎抗原5T4的新型單鏈scFv-Fc抗體，通過Dolaflexin可裂解連接子技術(shù)偶聯(lián)auristatin衍生物(AF-HPA)。ASN004目前處在臨床I期，針對的適應(yīng)癥包括乳腺癌、非小細胞肺癌、腸癌和卵巢癌。臨床前試驗顯示，ASN004可在多種腫瘤異種移植模型中誘導(dǎo)完全和持久的腫瘤消退，這些模型來源于具有廣泛5T4表達水平的人肺、乳腺、宮頸和胃腫瘤細胞系 ^[15]。

PF-06263507（ADC）是由Pfizer開發(fā)的抗體偶聯(lián)藥物，由anti-5T4人源化抗體、不可剪切連接子（mc）和MMAF組成。目前處于臨床I期，針對的適應(yīng)癥為非小細胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌。臨床前研究結(jié)果證實PF-06263507有優(yōu)秀的抗腫瘤活性。但在臨床I期劑量遞增試驗中，PF-06263507沒有觀察到ORR，存在眼部毒性（推測是MMAF引起的）為主的DLT。目前輝瑞已終止臨床開發(fā)。

SYD1875（ADC）是由Byondis B.V.開發(fā)的一款抗體偶聯(lián)藥物，由anti-5T4人源化抗體、可裂解連接子和雙卡霉素類似物組成。目前最高研發(fā)狀態(tài)為臨床I期，主要針對的適應(yīng)癥為實體瘤。

IBR854（CAR-NK）為英百瑞開發(fā)的CAR-raNK 細胞療法，核心是將靶向腫瘤抗原5T4的特異性抗體通過linker與同種異體外周血來源通用現(xiàn)貨型的NK細胞進行共價偶聯(lián)。目前IBR854已獲得國家藥監(jiān)局臨床試驗?zāi)驹S可，是國內(nèi)首個針對實體腫瘤的CAR-raNK細胞療法，全球首創(chuàng)的FIC產(chǎn)品。目前正處在早期臨床I期。

4、締碼5T4靶點產(chǎn)品助力新藥研發(fā)

締碼是一家專注于提供可成藥靶點臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務(wù)的生物技術(shù)公司，擁有創(chuàng)新型功能膜蛋白開發(fā)、單B細胞先導(dǎo)抗體發(fā)現(xiàn)、抗體工程改造與功能驗證平臺。締碼現(xiàn)可提供5T4靶點全系列產(chǎn)品與服務(wù)，產(chǎn)品涵蓋多種屬活性蛋白、流式驗證單抗及參照抗體。服務(wù)涵蓋人源化、親和力成熟、PTM風(fēng)險位點去除。另外，為了加速5T4靶點藥物研發(fā)，締碼還針對5T4制備了B細胞種子庫，最快20天可完成先導(dǎo)抗體分子篩選。

• 多種屬蛋白

• ELISA&流式驗證抗體

Anti-5T4 antibody(DM139); Rabbit mAb (DME100139)

Figure 3. Validation data of Anti-5T4 antibody. Human 5T4 protein, His tagged protein can bind Rabbit anti-5T4 monoclonal antibody in a linear range of 0.1-16 ng/ml (left); 5T4 protein is highly expressed on the surface of HEK293 cell membrane (right).

• ELISA&流式驗證參照抗體

Anti-5T4 reference mAb (BME100158)

Figure 4. Validation data of Anti-5T4 reference mAb. 5T4 protein is highly expressed on the surface of HEK293 cell membrane (left); Human 5T4 Protein, His Tag (PME100123) can bind Anti-5T4 reference mAb (BME100158) in a linear range of 0.64–16 ng/mL (right).

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