1986年，美國FDA批準(zhǔn)了世界上首個(gè)單抗治療性藥物—Orthoclone（抗CD3單抗OKT3）進(jìn)入市場，用于器官移植時(shí)的抗排斥反應(yīng)，從此抗體藥的研發(fā)越來越受到青睞，使其逐漸成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥家族中的重要成員。截至2023年1月末，F(xiàn)DA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）已累計(jì)批準(zhǔn)了119款治療性抗體新藥，而這個(gè)數(shù)字還在持續(xù)的增長。根據(jù)Precedence Research 姊妹公司 Towards Healthcare 發(fā)表的一項(xiàng)研究，預(yù)計(jì)到2028年，全球抗體藥市場收入將達(dá)到 4123.6 億美元左右，顯示出抗體藥物市場巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌隹臻g。目前，單抗藥物的研發(fā)技術(shù)日益走向成熟，其中通過展示平臺(tái)實(shí)現(xiàn)文庫系統(tǒng)的表達(dá)和目標(biāo)分子的篩選是單抗藥物研發(fā)過程中獲取高質(zhì)量抗體分子的重要手段?？贵w的展示平臺(tái)眾多，包括但不限于噬菌體展示、酵母菌展示、核糖體展示及哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示等等，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)憑借獨(dú)特的優(yōu)勢，正在引起越來越多的重視。那么什么是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)？與其他體外抗體文庫構(gòu)建系統(tǒng)相比，它的優(yōu)勢體現(xiàn)在哪里？除了抗體分子篩選，是否還有其它方面的應(yīng)用？本文將帶您了解相關(guān)內(nèi)容。
1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)的發(fā)展
標(biāo)志著哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)的成功建立是在2008年，Roger R. Beerli等人利用辛德畢斯（Sindbis）病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示抗體庫，并利用該展示文庫順利完成多個(gè)抗體的篩選。在該項(xiàng)研究中，研究者直接從志愿者的外周血單核細(xì)胞（PBMC）中分離具有特異性抗體的B細(xì)胞，獲得抗體的基因序列，利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體cDNA庫（scFv），將其連接到高滴度的Sindbis病毒載體中，該載體中包含表達(dá)抗體的信號(hào)肽和能夠使抗體固定在膜上的跨膜區(qū)（TM）。通過載體病毒感染BHK細(xì)胞，在BHK細(xì)胞膜上展示抗體并進(jìn)行篩選。該方法可以將抗體以完整IgG或Fab片段的形式展示抗體，并允許通過單次FACS分離特異性抗體，最終從陽性克隆中分離出的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列 [2]。這些技術(shù)的發(fā)展使得研究者們能夠更有效獲得具有特定功能的抗體，為藥物研發(fā)和臨床治療提供了更多的可能性。
圖1 利用辛德畢斯病毒構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng) [1]
2012年，Li等人以乙肝病毒特異性輕鏈抗體庫和重鏈抗體庫為基礎(chǔ)，通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)構(gòu)建二級(jí)抗體庫，成功篩選到乙肝病毒表面抗原特異性的抗體，這項(xiàng)研究為乙肝病毒的治療和預(yù)防提供了新的希望[2]。
2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)的原理
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)指的是應(yīng)用重組DNA技術(shù)將待展示基因序列與哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體跨膜序列融合表達(dá)，利用受體跨膜區(qū)的膜定位作用將過表達(dá)的重組外源蛋白展示在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體展示技術(shù)為例，該技術(shù)主要利用細(xì)胞表面表達(dá)抗體來篩選并獲取重組治療性單克隆抗體，步驟包含構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、表達(dá)抗原表位及抗原識(shí)別。前兩步可以統(tǒng)稱為構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示抗體庫，最后一步又稱為與靶標(biāo)特異性結(jié)合抗體的富集與篩選。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)中，以中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞和人胚胎腎臟293（HEK293）細(xì)胞兩個(gè)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。目前篩選出的適合這些表達(dá)系統(tǒng)的載體包括pcDNA系列載體、pDGB載體和部分病毒載體。
3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)優(yōu)劣勢
隨著細(xì)胞展示技術(shù)的發(fā)展, 細(xì)胞展示系統(tǒng)已從最初的原核展示系統(tǒng)擴(kuò)展到真核展示系統(tǒng)。其中噬菌體展示系統(tǒng)是原核細(xì)胞展示系統(tǒng)的代表，也是最早開發(fā)、應(yīng)用最廣泛的一類展示技術(shù)。酵母展示系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)是真核展示系統(tǒng)的代表。每種展示系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。與其他展示系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)在抗體藥開發(fā)中具有顯著優(yōu)勢。它的表達(dá)系統(tǒng)與人體的最為相似，能夠指導(dǎo)蛋白翻譯后的正確折疊，提供復(fù)雜的翻譯后加工修飾，所以哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能方面更能接近于天然的高等生物蛋白分子。但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖速度較微生物慢，并且通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示平臺(tái)構(gòu)建的展示庫容低于噬菌體或者酵母菌展示平臺(tái)，因此哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示平臺(tái)不適合于進(jìn)行特別大通量的非免疫庫篩選。下表中對(duì)比了噬菌體展示系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)的部分特性：
| 噬菌體展示系統(tǒng) | 哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng) | |
|---|---|---|
| 真核or原核 | 原核 | 真核 |
| 抗體展示形式 | ScFv & Fab | IgG & ScFv & Fab |
| 翻譯后修飾 | 無 | 有 |
| 生產(chǎn)周期 | 短 | 長 |
| 庫容量 | >10^10 | 10^6-10^8 |
| 生產(chǎn)成本 | 低 | 高 |
| 制備工藝 | 簡單 | 復(fù)雜 |
與哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)相比，利用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)外源蛋白或多肽時(shí)，外源蛋白或多肽與衣殼蛋白融合表達(dá)時(shí)存在無法預(yù)測的偏差。此外，被展示的外源蛋白或多肽分子量不能太大，否則會(huì)影響噬菌體的裝配，從而降低它感染宿主的能力。
同為真核表達(dá)系統(tǒng)的酵母菌展示系統(tǒng)也存在一些限制。首先，酵母菌展示系統(tǒng)只能展示特定類型的外源蛋白，而不是任何外源蛋白都可以展示。此外，酵母菌在表達(dá)外源蛋白時(shí)存在過度糖基化的可能性，所以只能用來生產(chǎn)不含糖基化位點(diǎn)的功能性蛋白，限制了其應(yīng)用范圍。而且，酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)后加工過程與哺乳動(dòng)物細(xì)胞差異較大，不能像哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)那樣最大程度還原靶標(biāo)蛋白的天然狀態(tài)。此外，酵母菌的遺傳穩(wěn)定性差，在傳代過程中容易丟失，從而造成難以重現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4、哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)的應(yīng)用
由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)具有翻譯后修飾及表達(dá)糖蛋白的明顯優(yōu)勢，可有效解決原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)的問題，它不僅能夠展示全長抗體，還能夠利用真核表達(dá)系統(tǒng)指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后修飾，通過該表達(dá)系統(tǒng)所合成的蛋白質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)和生化特性方面與人類存具有極高的相似度。所以，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)不僅可以應(yīng)用于抗體藥物研發(fā)、多肽藥物研發(fā)等，還可以在疫苗研發(fā)、生物治療和診斷等領(lǐng)域中發(fā)揮作用。 除了抗體篩選，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)還可以在其他許多方面應(yīng)用。例如，它可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和信號(hào)通路，幫助科學(xué)家深入理解疾病的病理生理過程。此外，該技術(shù)還可以用于開發(fā)新型藥物靶點(diǎn)、疾病診斷標(biāo)記物的鑒定和篩選等。 通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)構(gòu)建和篩選重組治療性單克隆抗體的研究，為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展和創(chuàng)新提供了重要的平臺(tái)。對(duì)于疾病治療和藥物開發(fā)來說，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用潛力巨大，將為人類健康帶來更多的福祉。
5、締碼生物基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)的技術(shù)平臺(tái)
應(yīng)用動(dòng)物免疫開發(fā)治療性抗體是最為有效的方案，但是未經(jīng)改造的動(dòng)物來源抗體不能用于臨床?？贵w人源化改造是抗體藥開發(fā)的必須階段。締碼生物致力于提供可成藥靶點(diǎn)臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務(wù)，旨在讓藥企跨過單抗平臺(tái)建立和先導(dǎo)抗體分子篩選的門檻，聚焦于藥靶生物學(xué)機(jī)制和可成藥性研究，加速臨床管線推進(jìn)。為此，締碼生物科技搭建了基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)的抗體工程平臺(tái)（DiLibraryTM），該平臺(tái)可用于抗體的深度人源化改造（人源化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)親和力的提升）、抗體親和力成熟、納米抗體和TCR的工程改造，以及犬源化和貓?jiān)椿绕渌N源的抗體改造。
- 服務(wù)流程
圖2 締碼抗體工程平臺(tái)服務(wù)流程
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BCMA抗體深度人源化案例展示
采用締碼生物科技DiLibraryTM人源化抗體庫進(jìn)行篩選后，我們獲得了比母本嵌合抗體親和力更高的克隆。親和力提升到pM級(jí)別。
- CEACAM5抗體深度人源化案例展示
采用常規(guī)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)進(jìn)行人源化，CEACAM5抗體親和力完全丟失；采用締碼生物科技DiLibraryTM人源化抗體庫進(jìn)行篩選后，獲得比嵌合抗體親和力更高的克隆。
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CCR8抗體親和力成熟案例展示
該案例中的anti-CCR8抗體具有人猴交叉屬性，針對(duì)該分子的LCDR3和HCDR3各突變一個(gè)氨基酸，即特異性地將對(duì)人源CCR8的親和力提高了約100倍，而不影響對(duì)猴源CCR8的親和力。
此外，作為一個(gè)專業(yè)聚焦于抗體藥臨床前開發(fā)公司，締碼生物在開發(fā)高質(zhì)量先導(dǎo)分子的上下游進(jìn)行了深度布局。為了獲得高質(zhì)量最為天然構(gòu)象的多穿膜蛋白抗體，我們還搭建了基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的多穿膜蛋白抗原制備平臺(tái)（DiMPro），該平臺(tái)充分利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢，可制備生產(chǎn)全長功能性多穿膜蛋白，最大程度的保證重組蛋白的天然構(gòu)象，點(diǎn)擊查看更多詳情>>
參考文獻(xiàn)：
【1】Beerli RR, Bauer M, Buser RB, Gwerder M, Muntwiler S, Maurer P, Saudan P, Bachmann MF. Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 23;105(38):14336-41.
【2】Li CZ, Liang ZK,Chen ZR,et al. Identification of HBsAg-specificantibodies from a mammalian cell displayed full-length humanantibody library of healthy immunized donor [J]. Cell MolImmunol, 2012,9(2):184-90.
