2012年，患有急性淋巴性白血病的女孩Emily Whitehead接受了賓夕法尼亞州科學(xué)家Carl June教授的第二代CD19 CAR-T細(xì)胞治療，成為第一位吃“CAR-T細(xì)胞免疫療法”這只螃蟹的兒童，并且大獲成功。這一成功案例讓CAR-T療法名聲大噪，也為其臨床應(yīng)用開辟了新的道路。自2017年FDA批準(zhǔn)了兩款CAR-T療法產(chǎn)品以來，目前美國已上市6款CAR-T相關(guān)產(chǎn)品，盡管中國起步相對較晚，但現(xiàn)也已有3款CAR-T產(chǎn)品上市。目前，全球CAR-T的研發(fā)管線正在迅速擴(kuò)張，除了對新靶點(diǎn)的探索，還涉及實體瘤等新適應(yīng)癥的拓展。那CAR-T究竟是是什么？血液腫瘤和實體瘤中分別有哪些靶點(diǎn)布局CAR-T？在介紹CAR-T療法之前，我們先來了解下CAR分子發(fā)展歷程……

1. CAR分子的發(fā)展歷程

嵌合抗原受體（CAR）的概念首次出現(xiàn)需要追溯到1989年，以色列科學(xué)家Prof. Zelig Eshhar在研究T細(xì)胞受體（TCR）的過程中發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體和 T 細(xì)胞受體（TCR）結(jié)構(gòu)相似，具有恒定區(qū)和可變區(qū)。抗體的可變區(qū)能特異性識別抗原，但TCR只能與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)呈遞的抗原片段結(jié)合。如果能將抗體的可變區(qū)轉(zhuǎn)移到TCR的恒定區(qū)上，這就能夠改變TCR的抗原特異性。于是，Eshhar 博士率先提出嵌合抗原受體（CAR）的概念，并成功構(gòu)建了第一代CAR。CAR基本由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3部分組成。胞外結(jié)構(gòu)域是抗原結(jié)合部位，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)域。經(jīng)過30多年的發(fā)展與改進(jìn)，CAR-T也經(jīng)歷了從一代到四代的多次迭代，每一代CAR都各有特點(diǎn)。

圖1 CAR分子的迭代[1,2]

如圖一所示，一代CAR包含CD3ζ和scFv，是將抗體的scFv與CD3ζ直接融合。處理后的T細(xì)胞在小鼠模型中顯示出抗癌活性 [3]，但一代CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增慢和持久性差，在在臨床試驗和人體抗癌方面效果不佳。與一代CAR相比，二代CAR增加了1個共刺激受體信號，可以讓CAR-T細(xì)胞在準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞的同時有效擴(kuò)增，并對腫瘤產(chǎn)生良好地殺傷效果。這個共刺激受體信號源于共刺激受體CD28或4-1BB，位于跨膜區(qū)和CD3信號傳導(dǎo)域之間。二代CAR目前擁有的臨床數(shù)據(jù)最多，穩(wěn)定性最高，工藝也最為成熟。三代CAR是在二代基礎(chǔ)上再引入1個共刺激域（CD28和4-1BB或OX40），以期望達(dá)到更好的信號傳導(dǎo)的效果。然而共刺激信號數(shù)量與信號傳導(dǎo)效果并不是完全呈正相關(guān)的。四代CAR是在二代CAR的基礎(chǔ)上引入了一個細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域共表達(dá)一些小分子物質(zhì)（如促炎癥細(xì)胞因子IL-12），能夠誘發(fā)由細(xì)胞因子觸發(fā)的信號通路或者阻斷影響CAR-T細(xì)胞功能的一些信號通路。在臨床前模型中，與第二代CAR相比，共表達(dá)細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域的存在大大增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞療法的療效，而且還成功地避免了全身毒性。

2、CAR-T療法工作原理

嵌合抗原受體T細(xì)胞（Chimeric Antigen Receptor T）免疫療法，簡稱CAR-T，是通過向T細(xì)胞中導(dǎo)入人工設(shè)計的CAR分子，使T細(xì)胞具有全新的靶向活化功能。當(dāng)抗原為癌細(xì)胞表面的抗原時，T細(xì)胞就可以特異的和癌細(xì)胞結(jié)合，從而通過細(xì)胞殺傷作用來對癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

在臨床上，CAR T 療法通常分為五步：

一是通過白細(xì)胞分離術(shù)獲得患者外周血中T細(xì)胞；

二是通過基因工程技術(shù)體外構(gòu)建CAR-T細(xì)胞；

三是體外擴(kuò)大培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞；

四是將足夠數(shù)量的CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)；

五是CAR-T細(xì)胞的胞外結(jié)構(gòu)域與癌細(xì)胞表面抗原結(jié)合并對癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷，回輸?shù)那皫滋煨枰芮嘘P(guān)注患者的身體反應(yīng)。

圖2  CAR-T細(xì)胞療法步驟

3、CAR-T靶點(diǎn)與腫瘤

自2012年Emily經(jīng)CAR-T治療痊愈后，CAR-T療法憑借在血液腫瘤領(lǐng)域的出色療效大放異彩，被稱為最有希望的腫瘤免疫療法之一。隨著CAR-T療法的不斷發(fā)展與優(yōu)化，CAR-T療法的適應(yīng)癥也逐步拓展到了實體瘤的治療。但無論是血液腫瘤還是實體瘤，CAR-T治療靶點(diǎn)的選擇是該療法是否能成功應(yīng)用的關(guān)鍵。CAR-T靶點(diǎn)選擇通常考慮兩方面因素，一是選擇的靶點(diǎn)能特異性的在腫瘤細(xì)胞表達(dá)；二是該靶點(diǎn)能夠通過CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)分子來識別和攻擊癌細(xì)胞。

3.1 血液腫瘤中熱門CAR-T靶點(diǎn)

目前，針對血液腫瘤的CAR-T療法，全球共有8款產(chǎn)品獲批上市，有近350款CAR-T產(chǎn)品處于臨床階段，適應(yīng)癥主要集中在淋巴細(xì)胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。針對血液腫瘤的CAR-T靶點(diǎn)共20多種，當(dāng)前臨床進(jìn)展較快的項目還是以CD19和BCMA為靶點(diǎn)，其他研究比較多的靶點(diǎn)還有CD138、CD33、CD7、CD22、CD20、CD30、CD123等。另外，隨著研究的不斷深入，也出現(xiàn)了CD38、GPRC5D、CD33、ROR1等新興靶點(diǎn)。CD19為I型單次跨膜糖蛋白，在B細(xì)胞發(fā)育早期和成熟B細(xì)胞階段表達(dá)，是B細(xì)胞表面生物標(biāo)志物之一。CD19能與補(bǔ)體受體CD21和CD81一起構(gòu)成成熟B細(xì)胞表面多分子復(fù)合物的主要信號傳導(dǎo)成分，在維持體液、抗原誘導(dǎo)和耐受誘導(dǎo)之間的平衡中起著關(guān)鍵作用。目前臨床上針對血液腫瘤適應(yīng)癥， CD19是所有血液腫瘤CAR-T靶點(diǎn)臨床項目數(shù)最多的靶點(diǎn)。該靶點(diǎn)的CAR-T產(chǎn)品涉及單靶點(diǎn)CAR、雙靶點(diǎn)等多種類型。其中雙靶點(diǎn)CAR多是與CD22或CD20組合。

BCMA是III型單穿膜跨膜蛋白，又稱為TNFRSF17，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的一員。該受體主要表達(dá)于成熟B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞表面，是B淋巴細(xì)胞成熟標(biāo)志物。目前臨床上針對多發(fā)性骨髓瘤瘤適應(yīng)癥。

GPRC5D是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，為7次跨膜蛋白，屬于一種孤兒受體，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)。目前臨床上以GPRC5D為CAR-T靶點(diǎn)的項目共有8項，其中處于臨床二期和臨床一期的均有4項。8項產(chǎn)品CAR-T產(chǎn)品中有三項是與BCMA組合的雙靶點(diǎn)CAR。

CD38是一種具有外酶功能的II型單次跨膜糖蛋白，在漿細(xì)胞以及其他淋巴和髓樣細(xì)胞群體上低量表達(dá)，也是多發(fā)性骨髓瘤治療靶點(diǎn)。

3.2 實體瘤中熱門CAR-T靶點(diǎn)

關(guān)于實體瘤的CAR-T產(chǎn)品，正如前面所提到的，CAR-T療法在實體瘤中的研究比血液腫瘤起步晚，目前處于臨床階段的CAR-T產(chǎn)品數(shù)量僅50項，大多數(shù)還是處于臨床前研究。目前臨床研究比較多的實體瘤CAR-T靶點(diǎn)有MSLN、Claudin 18.2、PD-1、HER2、NKG2D ligands和CEACAM5。另外，隨著研究的不斷開展，也有部分針對實體瘤的CAR-T產(chǎn)品進(jìn)入臨床，這些產(chǎn)品的靶點(diǎn)包括ROR1、GD2、GPC3、CD70、、MUC1、CLDN6、CTLA4、EGFR、AXL、FAP等。這些處于臨床階段的CAR-T療法針對的適應(yīng)癥主要集中在食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽管癌等。

MSLN（間皮素，Mesothelin）是細(xì)胞表面糖蛋白，在腫瘤（比如惡性間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等）中的表達(dá)非常廣泛。目前臨床上針對實體瘤適應(yīng)癥，以MSLN為靶點(diǎn)的CAR-T項目共有10項，其中4項在臨床二期，6項在臨床一期，臨床前研究還有5項。

Claudin 18.2是緊密連接蛋白家族Claudins中的成員之一，是四穿膜蛋白。在正常組織中，Claudin18.2僅在分化的胃粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)。病理狀態(tài)下，Claudin18.2在多種腫瘤（比如胃癌、食管癌、肺癌等）中的表達(dá)顯著上調(diào)。目前臨床上針對實體瘤適應(yīng)癥

4、締碼CAR-T先導(dǎo)分子篩選實驗平臺

自2019年起，我們已經(jīng)完成針對300+可成藥靶點(diǎn)的抗體先導(dǎo)分子開發(fā)，其中20+熱門CAR-T靶點(diǎn)（比如BCMA、CD123、CD38、CD70、GPRC5D、FCRL5、5T4、CLDN18.2等）完成了CAR分子體外驗證。此外，締碼生物現(xiàn)在已擁有良好的CAR-T細(xì)胞制備體系，客戶能夠直接從我們這里拿CAR-T細(xì)胞去做殺傷等功能實驗。

4.1 平臺流程

自2019年起，我們已經(jīng)完成針對400+可成藥靶點(diǎn)的抗體先導(dǎo)分子開發(fā)，其中20+熱門CAR-T靶點(diǎn)（比如BCMA、CD123、CD38、CD70、GPRC5D、FCRL5、5T4、CLDN18.2等）完成了CAR分子體外驗證。此外，締碼生物現(xiàn)在已擁有良好的CAR-T細(xì)胞制備體系，客戶能夠直接從我們這里拿CAR-T細(xì)胞去做殺傷等功能實驗。

4.2 部分CAR-T體外和體內(nèi)實驗案例展示

• 候選抗體與猴鼠交叉測試

• CAR-T細(xì)胞短效殺傷測試與細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ）的分泌檢測

• CAR-T細(xì)胞特異性激活與自激活評估

• CAR-T多輪連續(xù)殺傷測試

• 候選分子特異性分析

• CAR-T細(xì)胞體內(nèi)動物藥效學(xué)實驗

通過體內(nèi)和體外實驗的設(shè)定，我們可以篩選CAR分子中的抗體部分是否特異的靶向細(xì)胞，使您更加了解靶點(diǎn)的特點(diǎn)、CAR分子的靶向選擇性和殺傷機(jī)制。

在未來，隨著CAR-T療法的不斷發(fā)展與優(yōu)化，以及新的CAR靶點(diǎn)的不斷涌現(xiàn)，這一療法將有望應(yīng)用于更廣泛的腫瘤治療領(lǐng)域，為患者提供更多的治療選擇。同時，科學(xué)家和研究人員將繼續(xù)努力解決CAR-T療法在治療過程中可能出現(xiàn)的副作用和挑戰(zhàn)，以不斷改善這一治療方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mchayleh W, Bedi P, Sehgal R, Solh M. Chimeric Antigen Receptor T-Cells: The Future is Now. J Clin Med. 2019 Feb 7;8(2):207.

[2] Hughes-Parry HE, Cross RS, Jenkins MR. The Evolving Protein Engineering in the Design of Chimeric Antigen Receptor T Cells. Int J Mol Sci. 2019 Dec 27;21(1):204.

[3] Mitra A, Barua A, Huang L, Ganguly S, Feng Q, He B. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 2023 May 15;14:1188049.