2023年6月，BioNTech在美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）上公布了BNT211的首個(gè)人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)。BNT211一種針對(duì) Claudin-6 (CLDN6) 的CAR-T和mRNA疫苗的聯(lián)合療法，包含了靶向CLDN6的自體CAR-T及CLDN6編碼的納米顆粒mRNA疫苗CARVac。mRNA疫苗通過(guò)在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)CLDN6來(lái)刺激體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增，從而增強(qiáng)其療效。結(jié)合最新公布的研究數(shù)據(jù)，研究人員表示，CLDN6 CAR-T單獨(dú)或與 CARVac 聯(lián)合輸注都是安全的，并且對(duì) CLDN6 陽(yáng)性癌癥患者顯示出療效，其結(jié)果優(yōu)于其他實(shí)體瘤 CAR T 試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。那CLDN6會(huì)是繼ClDN18.2之后的下一個(gè)實(shí)體瘤治療的新興靶點(diǎn)嗎？與其他靶點(diǎn)相比，它有哪些優(yōu)勢(shì)？目前的靶向藥的競(jìng)爭(zhēng)格局又是如何？
1、CLDN6是什么？
緊密連接蛋白6（CLDN6）是緊密連接蛋白(Claudins，CLDNs)家族的成員之一。1998年，F(xiàn)uruse Mikio首次從雞肝中克隆出一種相對(duì)分子質(zhì)量約為22kDa的蛋白質(zhì)，分別將其命名為claudin-1(211 AA)和claudin-2 (230 AA) d蛋白[1]。目前已發(fā)現(xiàn)27種Claudin家族成員，其中24個(gè)在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。claudins主要在內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞中以組織特異性方式表達(dá)。根據(jù)不同claudins的序列同源性的高低可以將這些成員分為兩類(lèi)，分別是經(jīng)典型和非經(jīng)典型claudins。claudins是緊密連接（tight junctions, TJ）中一種具有代表性的跨膜蛋白家族，是構(gòu)成TJ的主要結(jié)構(gòu)，主要作用是維持TJ特有的柵欄和屏障功能。
CLDN6屬于經(jīng)典型claudins，與CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN7、CLDN8、CLDN9、CLDN10、CLDN14、CLDN15、CLDN17和CLDN19同源 [2]。2001年，Turksen K.從分化胚狀體(EB)的差異顯示分析中鑒定出CLDN6。但是，Turksen K.并不是分離CLDN6的第一人。CLDN6 cDNA最早是在1995年由Harrison S.M.團(tuán)隊(duì)從外胚層特異性文庫(kù)中分離出來(lái)的[3] [4]。
CLDN6的表達(dá)受多種因素動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。CLDN6一般在胃、胰腺、肺、腎等胎兒組織中表達(dá)，但在相應(yīng)的成人組織樣本中不表達(dá) [5]。CLDN6 是胚胎干(ES) 細(xì)胞中最早表達(dá)的上皮命運(yùn)決定蛋白之一，也是人類(lèi)多能干細(xì)胞 (hPSC) 的細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物 [6]。
2、CLDN6的結(jié)構(gòu)與功能？
人的CLDN6基因位于染色體16p13.3上，由220個(gè)氨基酸組成，分子量為23kDa，包含三個(gè)外顯子。如圖1所示，與其他CLDN一致，CLDN6具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)短的胞質(zhì)N端、一個(gè)C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域（較大的ECL1和一個(gè)較小的ECL2）和一個(gè)短的胞內(nèi)環(huán)。ECL1和細(xì)胞質(zhì)C末端的PDZ結(jié)合域是CLDN的典型結(jié)構(gòu)域。ECL1 在細(xì)胞之間交叉形成離子選擇性孔。不同claudins ECL1區(qū)上氨基酸位置和所帶電荷都有很大差異，C末端序列的不同也是區(qū)分claudin各個(gè)成員的另外一個(gè)差異點(diǎn)。C末端的PDZ結(jié)合序列和一些潛在的磷酸化位點(diǎn)能夠使claudin與胞質(zhì)內(nèi)含PDZ結(jié)構(gòu)的ZO-1、ZO-2、ZO-3、MUPP1等直接作用于其特定的結(jié)構(gòu)域，ZO-1、ZO-2又可直接與肌動(dòng)蛋白絲相連，從而使TJ蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的系統(tǒng)。
Figure 1. The structure of CLDN6 [5]
作為claudin蛋白家族成員之一，CLDN6也具有緊密連接的滲透性調(diào)節(jié)和屏障形成功能。關(guān)于滲透性調(diào)節(jié)功能，CLDN6對(duì)于新生兒腎近端小管的氯離子滲透性調(diào)節(jié)和內(nèi)耳淋巴囊上皮的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)至關(guān)重要 [7] [8]。在屏障方面，CLDN6對(duì)于維持肺上皮屏障很重要。此外，CLDN6主要參與早產(chǎn)時(shí)表皮滲透屏障（EPB）的形成。與其他claudin成員不同的是，CLDN6是唯一具有潛在特異性的CLDN，因?yàn)樗梢约せ罴?xì)胞粘附信號(hào)并調(diào)節(jié)核受體的活性。CLDN6可受刺激和轉(zhuǎn)錄因子、DNA甲基化、磷酸化和棕櫚酰化的調(diào)節(jié)。
3、CLDN6與實(shí)體瘤
腫瘤細(xì)胞常常表現(xiàn)為細(xì)胞間緊密連接喪失，這也可能是腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展進(jìn)程中重要一步。緊密連接蛋白滲透功能的改變將導(dǎo)致更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其他因子滲入供腫瘤生長(zhǎng)。作為緊密連接的主要結(jié)構(gòu)，Claudins的異常表達(dá)可導(dǎo)致上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞及功能受損，其在多種上皮來(lái)源的腫瘤中異常表達(dá)。比如Cliaudin2在前列腺癌、乳腺癌中，Claudin3在腎癌、膀胱癌中，Claudin4在腎癌、肝癌中的表達(dá)均是下調(diào)的。與其他CLDN不同的是，CLDN6是一種腫瘤特異性蛋白，存在于多種實(shí)體腫瘤中，包括卵巢、子宮內(nèi)膜、肺、胃和睪丸，但在健康的成人組織中不存在。基于此，近年來(lái)關(guān)于CLDN6在癌癥中作用的研究越來(lái)越多。隨著研究結(jié)果的不斷披露，CLDN6也逐步成為了腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。
關(guān)于作用機(jī)制，目前還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的經(jīng)典途徑，以CLDN6在乳腺癌中的作用為例：吉林大學(xué)全成實(shí)教授團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究證實(shí)，CLDN6的下調(diào)是通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）介導(dǎo)的DNA甲基化來(lái)調(diào)節(jié)的，而DNMT1依賴(lài)于SMAD2通路。通過(guò)下調(diào)DNMT1表達(dá)抑制CLDN6甲基化可抑制乳腺癌細(xì)胞的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)移（EMT）、遷移和侵襲 [9]。在此項(xiàng)研究之前，全教授團(tuán)隊(duì)的研究也證明claudin-6基因沉默可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)通過(guò)p38 MAPK 信號(hào)通路增加 MMP-2 活性，進(jìn)一步促進(jìn)人類(lèi)乳腺癌的惡性進(jìn)展 [10]。此外，還有多項(xiàng)研究提示乳腺癌細(xì)胞中CLDN6的表達(dá)會(huì)受到多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)，包括HIF-1α通路 [11]、ASK1-p38/c-Jun N通路[12]和 (Erβ)/Erα-Beclin1通路 [13]。
4、CLDN6靶向藥研究進(jìn)展
CLDN6 研究用于治療癌癥的新興免疫療法，包括單克隆抗體、雙特異性抗體 (BsAb)和抗體藥物偶聯(lián)物 (ADC)。目前已上臨床的項(xiàng)目共計(jì)7項(xiàng)，單抗1項(xiàng)，雙抗2項(xiàng)，ADC藥物2項(xiàng)，CAR-T療法2項(xiàng)。
Figure 2. The types of drugs targeting CLDN6 [5]
4.1 ASP1650
ASP1650是安斯泰來(lái)開(kāi)發(fā)的一款靶向CLDN6的嵌合小鼠/人類(lèi)IgG1抗體，當(dāng)前處于II期臨床。該單抗藥是目前進(jìn)展最快的CLDN6單克隆抗體，但也是最早因臨床結(jié)果不理想而終止的項(xiàng)目。2022年公開(kāi)的的II期臨床結(jié)果表明，ASP1650在復(fù)發(fā)/難治性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤（GCT）患者（19名男性）中沒(méi)有顯示出具有臨床意義的單藥活性，目前該管線(xiàn)已停止開(kāi)發(fā) [14]。
4.2 BNT211&BNT142
德國(guó)藥企BioNTech在2023年ASCO年會(huì)上公布了其CLDN產(chǎn)品組合的多項(xiàng)更新，包括BNT211和BNT142。其中，最引人注目的是治療實(shí)體瘤的BNT211最新研究結(jié)果。
BNT211包含兩個(gè)部分，一部分是靶向CLDN-6的自體CAR-T細(xì)胞療法，另一部分是基于BioNTech專(zhuān)有mRNA-lipoplex技術(shù)開(kāi)發(fā)的CLDN6編碼mRNA疫苗(CARVac)。該療法旨在誘導(dǎo)針對(duì)各種 CLDN6陽(yáng)性實(shí)體瘤的強(qiáng)大免疫反應(yīng)，例如卵巢癌、肉瘤、睪丸癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌。目前，BNT211 正在 CLDN6陽(yáng)性復(fù)發(fā)/難治性晚期實(shí)體瘤患者中加入或不加入 CARVac 聯(lián)合進(jìn)行 1/2 期試驗(yàn)。最新結(jié)果表明，在CLDN6陽(yáng)性復(fù)發(fā)/難治性晚期實(shí)體瘤患者中，加入或不加入CLDN6編碼mRNA疫苗CARVac，都展示出積極的活性和可控的安全性數(shù)據(jù)。截至2023年3月，在接受BNT211聯(lián)合或不聯(lián)合CARVac治療的17名可評(píng)估患者中，總體客觀緩解率（ORR）為41%，疾病控制率（DCR）達(dá)到65%。其中1名接受自動(dòng)化BNT211治療的睪丸癌患者獲得手術(shù)完全緩解（sCR）。還有5名患者達(dá)到部分緩解（PR），3名患者達(dá)到病情穩(wěn)定（SD）。在自動(dòng)化工藝制造的過(guò)程中，BNT211維持了療效，這對(duì)擴(kuò)大生產(chǎn)過(guò)程提供了支持 [15]。
BNT142是編碼CD3 x CLDN6雙特異性的mRNA疫苗。靜脈注射后，BNT142被引導(dǎo)至肝臟，兩種RNA在肝臟中被翻譯、組裝并作為抗體分泌到循環(huán)中。由于mRNA疫苗毒性容易在肝臟內(nèi)蓄積，因此肝毒性的報(bào)告具有重要意義。目前BNT142正在進(jìn)行臨床I期劑量遞增臨床試驗(yàn)。
4.3 TORL-1-23
TORL-1-23是由TORL BioTherapeutics開(kāi)發(fā)的由抗CLDN6單抗與微管蛋白抑制劑MMAE通過(guò)可切割連接子偶聯(lián)生成的抗體偶聯(lián)藥物（ADC）。體外實(shí)驗(yàn)表明，TORL-1-23具有高度選擇性，它能選擇性的與CLDN6過(guò)表達(dá)細(xì)胞系強(qiáng)力結(jié)合，而不與其他緊密蛋白過(guò)表達(dá)細(xì)胞系結(jié)合，如CLDN3、CLDN4 和 CLDN9。ASCO年會(huì)上公布的TORL-1-23 臨床I期試驗(yàn)結(jié)果顯示，在25位平均接受過(guò)5種前期治療的難治性癌癥患者中，28%的患者獲得確認(rèn)緩解。該公司計(jì)劃招募更多CLDN6陽(yáng)性卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌患者，并且在決定2期臨床推薦劑量之后擴(kuò)展到其它CLDN6陽(yáng)性癌癥類(lèi)型。
4.4 DS-9606
DS-9606是由Daiichi Sankyo基于苯并二氮卓衍生物（PBD）構(gòu)建的靶向CLDN6 ADC藥物。臨床前研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，此技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建的靶向Claudin6 ADC表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。目前DS-9606正在開(kāi)展臨床1期研究，這項(xiàng)研究旨在評(píng)估DS-9606a在晚期實(shí)體瘤患者中的安全性和耐受性。該研究的次要目標(biāo)將評(píng)估DS-9606a的藥代動(dòng)力學(xué)特性，研究DS-9606a的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存期，并評(píng)估DS-9606a的免疫原性。
4.5 CLDN6-CAR-NK cell therapy
CLDN6-CAR-NK cell therapy是一項(xiàng)目前正在廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院開(kāi)展的1/2期臨床實(shí)驗(yàn)，暫時(shí)還未公布任何結(jié)果。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)選擇具有Claudin6表達(dá)的晚期癌癥患者，對(duì)患者進(jìn)行PBMC單采并分離NK細(xì)胞，用Claudin6靶向CAR轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞，根據(jù)需要擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞數(shù)量，測(cè)試Claudin6-CAR-NK細(xì)胞的質(zhì)量和殺傷活性，然后移植回患者體內(nèi)通過(guò)全身或局部輸注，并根據(jù)需要密切隨訪以收集相關(guān)結(jié)果。
4.6 AMG 794
AMG 794是一款基于雙特異性T細(xì)胞銜接蛋白(bispecific T cell engager，BITE?)技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的一款半衰期延長(zhǎng)的雙特異性抗體，可結(jié)合人和食蟹猴CLDN6和CD3。AMG 794可以重定向T細(xì)胞以殺死表達(dá)CLDN6的腫瘤細(xì)胞。目前處于臨床I期招募患者階段。
5、締碼全長(zhǎng)CLDN6蛋白，助力CLDN6生物療法開(kāi)發(fā)
CLDN6與CLDN3、CLDN4和CLDN9等Claudins緊密相關(guān)，且存在遺傳重疊，這對(duì)CLDN6靶向治療的研發(fā)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。但與CLDN6不同，這些緊密相關(guān)的蛋白在正常健康組織中表達(dá)，所以藥物對(duì)CLDN6的高度選擇性是CLDN6靶向治療研發(fā)的關(guān)鍵突破口。基于此，高質(zhì)量的抗原顯得尤為重要，締碼生物全長(zhǎng)CLDN6蛋白開(kāi)發(fā)部分應(yīng)用數(shù)據(jù)如下:
Figure 3. Validation data of purified full-length human CLDN6 Nanodisc (Cat. FLP100008). Human CLDN6-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE (left); CLDN6-Nanodisc (Cat. FLP100008) can bind to anti-CLDN6 mAb (Cat. BME100082) and the EC50 is 66.99ng/ml (right).
- CLDN6相關(guān)產(chǎn)品
參考文獻(xiàn)：
[1] Furuse M ,Fujita K. Claudin 1 and -2;novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occlu-din [J].Cell Biol,1998,141(7) ;1539 ~ 1550.
[2] Günzel D., Fromm M. Claudins and other tight junction proteins. Compr. Physiol. 2012;2:1819–1852.
[3] Turksen K., Troy T.C. Claudin-6: A novel tight junction molecule is developmentally regulated in mouse embryonic epithelium. Dev. Dyn. Off. Publ. Am. Assoc. Anat. 2001;222:292–300.
[4] Harrison S.M., Dunwoodie S.L., Arkell R.M., Lehrach H., Beddington R.S. Isolation of novel tissue-specific genes from cDNA libraries representing the individual tissue constituents of the gastrulating mouse embryo. Development. 1995;121:2479–2489.
[5] Qu H, Jin Q, Quan C. CLDN6: From Traditional Barrier Function to Emerging Roles in Cancers. Int J Mol Sci. 2021 Dec 14;22(24):13416.
[6] Ben-David U, Nudel N, Benvenisty N. Immunologic and chemical targeting of the tight-junction protein Claudin-6 eliminates tumorigenic human pluripotent stem cells. Nat Commun. 2013;4:1992.
[7] Sas D, Hu M, Moe OW, Baum M. Effect of claudins 6 and 9 on paracellular permeability in MDCK II cells. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008 Nov;295(5):R1713-9.
[8] Kitajiri SI, Furuse M, Morita K, Saishin-Kiuchi Y, Kido H, Ito J, Tsukita S. Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear. Hear Res. 2004 Jan;187(1-2):25-34.
[9] Lu Y, Wang L, Li H, Li Y, Ruan Y, Lin D, Yang M, Jin X, Guo Y, Zhang X, Quan C. SMAD2 Inactivation Inhibits CLDN6 Methylation to Suppress Migration and Invasion of Breast Cancer Cells. Int J Mol Sci. 2017 Aug 30;18(9):1863.
[10] Ren Y, Wu Q, Liu Y, Xu X, Quan C. Gene silencing of claudin-6 enhances cell proliferation and migration accompanied with increased MMP?2 activity via p38 MAPK signaling pathway in human breast epithelium cell line HBL?100. Mol Med Rep. 2013 Nov;8(5):1505-10.
[11] Jia Y, Guo Y, Jin Q, Qu H, Qi D, Song P, Zhang X, Wang X, Xu W, Dong Y, et al. A SUMOylation-dependent HIF-1α/CLDN6 negative feedback mitigates hypoxia-induced breast cancer metastasis. J Exp Clin Cancer Res. 2020;39:42.
[12] Guo Y, Lin D, Zhang M, Zhang X, Li Y, Yang R, Lu Y, Jin X, Yang M, Wang M, et al. CLDN6-induced apoptosis via regulating ASK1-p38/JNK signaling in breast cancer MCF-7 cells. Int J Oncol. 2016;48:2435–2444.
[13] Song P, Li Y, Dong Y, Liang Y, Qu H, Qi D, Lu Y, Jin X, Guo Y, Jia Y, et al. Estrogen receptor β inhibits breast cancer cells migration and invasion through CLDN6-mediated autophagy. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38:354.
[14] Adra N, Vaughn DJ, Einhorn LH, Hanna NH, Funt SA, Rosales M, Arozullah A, Feldman DR. A phase II study assessing the safety and efficacy of ASP1650 in male patients with relapsed refractory germ cell tumors. Invest New Drugs. 2022 Oct;40(5):1087-1094.
[15] Mackensen A, Haanen JBAG, Koenecke C, et al. CLDN6 CAR-T cell therapy of relapsed/refractory solid tumors ± a CLDN6-encoding mRNA vaccine: dose escalation data from the BNT211-01 phase 1 trial using an automated product. J Clin Oncol. 2023;41(suppl 16):2518.
