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膜蛋白,尤其是多穿膜蛋白如GPCR家族、離子通道蛋白等,在膜運輸、信號轉導、細胞穩(wěn)態(tài)和能量代謝等生理過程中扮演重要角色。盡管這些蛋白質非常重要,但由于其存在多個疏水區(qū),如何獲得穩(wěn)定且不聚集的天然構象膜蛋白仍然是其靶向藥開發(fā)的一大難點。去垢劑是全長膜蛋白表達純化最早解決方案。去垢劑是一類兩親性分子,具有疏水端和親水端,可以將磷脂中的膜蛋白替換出來,從而實現(xiàn)膜蛋白可溶。但去垢劑本身具有毒性,其存在會損害膜蛋白的結構與活性,同時也限制了膜蛋白的下游應用?;诖耍芯咳藛T又進一步開發(fā)了去垢劑的替代方案-納米圓盤Nanodisc。Nanodisc因固定膜蛋白支架材料不同亦可進一步分為:Synthetic Nanodisc和MSP Nanodisc。二者因含有磷脂雙脂膜會非特異性與細胞膜融合,故而不推薦用于下游細胞實驗。
從應用的角度出發(fā),締碼生物經(jīng)過多次嘗試,開發(fā)了一種無需使用去污劑即可穩(wěn)定膜蛋白的簡單方法,PeptiNanodisc。PeptiNanodisc,顧名思義,是利用特殊肽段包裹住膜蛋白的疏水部分(類似于肽盤),從而保護其不受水溶液的影響。由于不存在磷脂和去垢劑,利用PeptiNanodisc平臺表達出的膜蛋白可以用于細胞實驗。而且,理論上肽盤可以像‘通用支架’一樣,適用于各種膜蛋白,不受蛋白大小限制。
CAR陽性率是評價CAR-T產品有效性作的關鍵指標,其數(shù)量和比例尤為重要。無論是臨床前還是臨床應用階段,CAR陽性率的檢測都是CAR-T重要的質量控制基石。針對不同的CAR結構部分,目前檢測CAR陽性率的方法包括Protein L、Anti-Fab抗體、抗獨特型抗體、靶點蛋白和抗G4S Linker抗體。其中,靶點蛋白是特異性最高,可同步評估CAR與靶標結合能力的方法。想用功能性全長膜蛋白檢測CAR陽性率,PeptiNanodisc是最佳選擇。
結果表明:CLDN18.2 PeptiNanodisc (FLP420014)檢測CLDN18.2CAR陽性率結果與陽性參照(Protein L-647和G4S-PE檢測)效率相當,由于CLDN18.2 PeptiNanodisc是通過抗原抗體特異性與CLDN18.2 CAR結合,是檢測方法中特異性最高的一種,所以,PeptiNanodisc可作為對應膜蛋白靶點CAR陽性率檢測的最佳方案。
結果表明:GPRC5D PeptiNanodisc (FLP400011)檢測GPRC5D CAR陽性率與G4S-PE檢測方法效果相當。
標記PeptiNanodisc,顧名思義,指的是帶標記的PeptiNanodisc全長膜蛋白。不同于傳統(tǒng)的標記蛋白,標記PeptiNanodisc是通過先標記后組裝的方式,將biotin以及FITC等小分子直接偶聯(lián)在多肽上,然后進行PeptiNanodisc的組裝,從而得到biotin或熒光標記的膜蛋白。
結果表明:FITC標記CLDN18.2 peptiNanodisc檢測CLDN18.2 CAR陽性率與G4S-PE方法檢測結果相當,且無需熒光二抗,操作更方便。
利用功能ELISA分別檢測液體狀態(tài)和凍干粉狀態(tài)下CLDN6 PeptiNanodisc (FLP420008)與CLDN6抗體結合活性,結果顯示EC50并無顯著差異。
利用功能ELISA檢測CLDN6 PeptiNanodisc分別在-20℃、37℃ 24h、37℃ 48h、37℃ 72h條件下,其與CLDN6抗體結合活性,結果顯示EC50并無顯著差異。
SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn):不同條件下(-80℃液體狀態(tài)、-20℃凍干粉狀態(tài)及凍干粉狀態(tài)37℃分別放置24h、48h、72h),CLDN6 PeptiNanodisc呈現(xiàn)的條帶位置及豐度無明顯差異。
利用功能ELISA分別檢測液體狀態(tài)和凍干粉狀態(tài)下GPRC5D PeptiNanodisc與GPRC5D抗體結合活性,結果顯示EC50并無顯著差異。
利用功能ELISA檢測GPRC5D PeptiNanodisc分別在-20℃、37℃ 24h、37℃ 48h、37℃ 72h條件下,其與GPRC5D抗體結合活性,結果顯示EC50并無顯著差異。
SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn):不同條件下(-80℃液體狀態(tài)、-20℃凍干粉狀態(tài)及凍干粉狀態(tài)37℃分別放置24h、48h、72h),GPRC5D PeptiNanodisc條帶位置及豐度無明顯差異。
Full Length Transmembrane Proteins
SKU: FLP400011 Target: GPRC5D Tag: C-Flag Tag
Price:10 μg ¥7000.00 ;50 μg ¥33000.00 ; 100 μg ¥60500.00
Full Length Transmembrane Proteins
SKU: FLP420008 Target: CLDN6 Tag: C-Flag&Strep Tag
Price:10 μg ¥6300.00 ;50 μg ¥29700.00 ; 100 μg ¥54500.00
Full Length Transmembrane Proteins
SKU: FLP420014 Target: CLDN18.2 Tag: C-Flag&Strep Tag
Price:10 μg ¥6300.00 ;50 μg ¥29700.00 ; 100 μg ¥54500.00