尋找在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，而在正常細(xì)胞上不表達(dá)或低表達(dá)的靶點(diǎn)對(duì)腫瘤免疫而言至關(guān)重要。ROR1是一個(gè)非常有潛力的藥物靶點(diǎn)，它在多種實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤中都具有差異化的高度表達(dá)，而在成人健康組織中并不表達(dá)。這意味著ROR1有望成為一個(gè)具有廣譜抗癌潛力的新藥靶點(diǎn)。
1、ROR1結(jié)構(gòu)與表達(dá)分布
ROR1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1）是一種I型跨膜蛋白，屬于受體酪氨酸激酶樣孤兒受體（ROR）家族。該家族的命名是因?yàn)槠渑潴w多年未被識(shí)別?，F(xiàn)在已知ROR家族成員是Wnt家族信號(hào)分子Wnt5a/b和Wnt16的受體，Wnt5a為主要配體。
如下圖所示，ROR1是單次跨膜受體，主要包括三部分：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)（ECD）可進(jìn)一步分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-Like）、卷曲結(jié)構(gòu)域（FZD）及環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（KD）。FZD可與配體Wnt5a結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)非經(jīng)典Wnt信號(hào)。KD可介導(dǎo)ROR1與其他受體如ROR2的相互作用。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（ICD）包含一個(gè)酪氨酸激酶樣結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)富含絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域和一個(gè)富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。
Figure 1 The structure of ROR1 [1]
ROR1在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)，可參與細(xì)胞分裂、增殖、遷移活動(dòng)的調(diào)節(jié)，同時(shí)也能參與神經(jīng)、骨骼和血管等器官的生成。隨著胎兒發(fā)育的進(jìn)程，ROR1的表達(dá)逐漸下降。在兒童和成人階段，ROR1幾乎在所有正常組織中的表達(dá)都很低或不表達(dá)。相反，ROR1在多種癌癥中表達(dá)，包括血液學(xué)癌癥，如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)和實(shí)體瘤（卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤和結(jié)腸直腸癌等）。ROR1的表達(dá)特性使得該蛋白成為癌癥治療的理想藥物靶點(diǎn)。
2、ROR1信號(hào)與腫瘤發(fā)生
研究表明，腫瘤細(xì)胞中ROR1的高表達(dá)有助于提高腫瘤細(xì)胞的存活率，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和趨化。表達(dá)ROR1的血液腫瘤和實(shí)體腫瘤具有很高的自我更新潛力，表現(xiàn)出更高的生存率和遷移率，并與不良預(yù)后相關(guān)。
Wnt5a-ROR1通過(guò)非典型Wnt通路參與并上調(diào)YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄和/或多梳復(fù)合蛋白BMI-1表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和耐藥中發(fā)揮重要作用。Wnt5a結(jié)合ROR1后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，活化AKT，進(jìn)而磷酸化BMI-1，促進(jìn)基因組不穩(wěn)定性、癌細(xì)胞增殖和耐藥。Wnt5a與ROR1/FZD復(fù)合物結(jié)合后，通過(guò)Gα12/13結(jié)合激活RhoA，抑制Lats1/2活性，從而導(dǎo)致YAP/TAZ去磷酸化和核轉(zhuǎn)位。YAP/TAZ與TEADs結(jié)合可以誘導(dǎo)干細(xì)胞和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。YAP/TAZ轉(zhuǎn)錄的增加，反過(guò)來(lái)上調(diào)ROR1的表達(dá)。
Figure 2 ROR1 signaling pathway and tumor [2]
3、ROR1與腫瘤免疫
目前開(kāi)發(fā)的靶向ROR1的基于抗體的免疫療法包括ROR1單克隆抗體、抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)、雙特異性抗體(BiTE)和嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞。當(dāng)然，靶向ROR1的除了免疫療法，也還有小分子抑制劑，這里我們重點(diǎn)了解下靶向ROR1免疫療法在臨床上研究進(jìn)展。
| 藥物類型 | 英文名稱 | 研發(fā)代碼 | 研發(fā)階段 | 公司 |
| ROR1 ADC | Zilovertamab vedotin | MK-2140; VLS-101 | Phase III | 默沙東 |
| LCB-71 | CS-5001; LCB-71; ABL-202 | Phase I | 基石藥業(yè) | |
| NBE-002 | BI-3702025; NBE-002 | Phase II | NBE-Therapeutics | |
| CAR-T | LYL-797 | LYL-797 | Phase I | Lyell Immunopharma Inc |
| PRGN-3007 | PRGN-3007 | Phase I | Precigen Inc | |
| ONCT-808 | ONCT-808 | Phase II | Oncternal Therapeutics Inc | |
| 雙特異抗體 | NVG-111 | NVG-111 | Phase II | NovalGen Ltd |
| EMB-07 | EMB-07 | Phase I | EpimAb | |
| 四特異性抗體 | GNC-035 | GNC-035 | Phase I | Systimmune |
| 單克隆抗體 | Zilovertamab | UC-961 | Phase III | Oncternal Therapeutics Inc |
3.1 抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）
ADC是一種靶向治療藥物，通過(guò)化學(xué)連接物將細(xì)胞毒性小分子偶聯(lián)到單克隆抗體上?？贵w藥物偶聯(lián)物可選擇性地向抗原陽(yáng)性的癌細(xì)胞輸送有毒物質(zhì)。
- Zilovertamab vedotin (VLS-101)
Zilovertamab vedotin原研公司為VelosBio，該公司已于2020年11月5日由默克以27.5億美元收購(gòu)。Zilovertamab vedotin是一款靶向ROR1的ADC藥物，由靶向ROR1的單克隆抗體通過(guò)蛋白水解可裂解接頭與單甲基auristatin E (MMAE）偶聯(lián)。MMAE是一種通過(guò)阻斷微管蛋白聚合抑制細(xì)胞分裂的藥物，更多關(guān)于MMAE內(nèi)容>>
Zilovertamab vedotin目前最高研發(fā)狀態(tài)是phase III，DAR均值為4，用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤患者。在2023年ASH會(huì)議上，默沙東披露了Zilovertamab vedotin治療復(fù)發(fā)或難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤 (DLBCL)的2期Waveline-004研究的最新結(jié)果。在這次更新的Waveline-004結(jié)果中，zilovertamab vedotin在R/R DLBCL患者中依然表現(xiàn)出具有臨床意義的抗腫瘤活性。這些患者主要是一些：在自體干細(xì)胞移植 (ASCT) 或嵌合抗原受體 (CAR-T) 細(xì)胞治療后病情進(jìn)展或不符合ASCT和/或CAR T細(xì)胞治療的條件的 R/R DLBCL 患者，治療選擇有限。zilovertamab vedotin 的安全性是可控的，并且與已知的含MMAE藥物的安全性一致。
- LCB71 (CS5001)
LCB71最初是由韓國(guó)的兩家生物制藥公司LegoChem Biosciences和ABL Bio開(kāi)發(fā)，2020年10月29日基石藥業(yè)以1000萬(wàn)美元的首付款+3.535億美元里程碑金額引進(jìn)LCB71。LCB71 是一款由靶向ROR1的人源單克隆抗體構(gòu)成的ADC。目前最高研發(fā)階段為Phase I，針對(duì)的適應(yīng)癥包括實(shí)體瘤和血液腫瘤。
該ADC藥物具有獨(dú)特的設(shè)計(jì)，通過(guò)定向偶聯(lián)技術(shù)，LCB71結(jié)合了特有的β-葡萄糖苷酸連接子和吡咯并苯二氮卓類（PBD）前毒素二聚體。連接子和前毒素均能被溶酶體β-葡萄糖醛酸酶切割，而β-葡萄糖醛酸酶在許多癌細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)。這使得LCB71只有在到達(dá)腫瘤后，其連接子被切割釋放PBD前毒素，繼而PBD前毒素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被激活，從而殺死腫瘤細(xì)胞。這種連接子加前毒素的“雙控”機(jī)制有效地解決了與傳統(tǒng)PBD載荷有關(guān)的典型毒性問(wèn)題，擁有更好的安全性。
LCB71的多地區(qū)I期臨床試驗(yàn)已在美國(guó)和澳大利亞通過(guò)劑量遞增推進(jìn)，并顯示出良好的安全性和耐受性。2023年4月24日，基石藥業(yè)宣布LCB71的多區(qū)域I期臨床試驗(yàn)在中國(guó)完成首例患者入組。基石藥業(yè)首席執(zhí)行官楊杰博士表示：這標(biāo)志著我們 Pipeline 2.0 戰(zhàn)略的另一個(gè)里程碑。隨著中國(guó)研究中心的加入，這一重要項(xiàng)目的步伐將進(jìn)一步加快。
- NBE-002
NBE-002最初由NBE-Therapeutics開(kāi)發(fā)，2020年12月10日勃林格殷格翰宣布以約15億美元的價(jià)格收購(gòu)NBE-Therapeutics，從而獲得NBE-002。NBE-002是一種ADC，由一種新型抗人 ROR1 單克隆抗體抗體XBR1-402與蒽環(huán)類藥物PNU-159682的衍生物組成。HuXBR1-402是從兔抗體庫(kù)中通過(guò)噬菌體展示篩選出的兔/人嵌合單抗。
NBE-002在乳腺癌、肺腺癌、卵巢癌和肉瘤的患者源性異種移植模型中顯示出顯著的抗腫瘤活性。目前該藥物正在美國(guó)針對(duì)晚期實(shí)體瘤患者首次開(kāi)展人體 1/2 期研究，旨在評(píng)估 NBE-002在晚期實(shí)體瘤患者中的進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)推薦劑量、安全性、耐受性、抗腫瘤活性、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)。
3.2 ROR1的CAR-T細(xì)胞療法
構(gòu)建靶向ROR1的CAR-T細(xì)胞療法也可以起到針對(duì)性殺傷ROR1陽(yáng)性癌細(xì)胞的作用。
- LYL-797
LYL-797是由Lyell Immunopharma開(kāi)發(fā)的一種靶向ROR1的CAR-T 細(xì)胞療法，它結(jié)合了遺傳和表觀遺傳重編程技術(shù)Gen-R和Epi-R，以克服實(shí)體瘤中CAR-T細(xì)胞療法的障礙。ROR1 特異性CAR包含源自R12兔單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv），可高度特異性地識(shí)別并結(jié)合人ROR1。
Gen-R是一種離體基因重編程技術(shù)，可將CAR-T細(xì)胞改造為過(guò)度表達(dá)c-Jun。激活蛋白1 (AP-1) 的失調(diào)與CAR-T細(xì)胞耗竭有關(guān)，研究表明c-Jun的過(guò)度表達(dá)可以使CAR-T細(xì)胞不易耗竭，從而增強(qiáng)血液腫瘤和實(shí)體瘤臨床前模型中的抗腫瘤功效和持久性。Epi-R是一種專有的優(yōu)化制造工藝，可維持T細(xì)胞產(chǎn)品的干細(xì)胞表型和功能。在臨床前研究中，與傳統(tǒng)的ROR1 CAR-T細(xì)胞相比，用Gen-R和Epi-R重新編程的LYL797細(xì)胞在ROR1+腫瘤細(xì)胞存在的情況下功能活性得到提高 [3]。
LYL797-101正處于一項(xiàng)Phase I臨床試驗(yàn)（NCT05274451），該試驗(yàn)旨在評(píng)估LYL797在ROR1+ 三陰乳腺癌（TNBC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和抗腫瘤活性，目前正處于招募狀態(tài)。
- PRGN-3007
PRGN-3007是Precigen公司基于非病毒UltraCAR-T?治療平臺(tái)產(chǎn)生的多基因、自體CAR-T細(xì)胞療法。PRGN-3007使用單個(gè)多基因轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，利用睡美人平臺(tái)（SB系統(tǒng)）共表達(dá)靶向ROR1嵌合抗原受體、膜結(jié)合白介素-15（mbIL15）、控制開(kāi)關(guān)以及內(nèi)在阻斷 PD-1 的新機(jī)制基因表達(dá)。目前，PRGN-3007正在美國(guó)針對(duì)ROR1+血液腫瘤和實(shí)體腫瘤開(kāi)展1/1b階段的臨床試驗(yàn)以測(cè)試該藥物的耐受性。
- ONCT-808
ONCT-808是一種由Oncternal Therapeutics公司開(kāi)發(fā)的一種靶向ROR1的自體CAR-T細(xì)胞療法，目前正在進(jìn)行1/2期臨床試驗(yàn)（NCT05588440），用于治療復(fù)發(fā)或難治性侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤患者，包括先前CD19 CAR T治療失敗的患者。該臨床試驗(yàn)旨在評(píng)估 ONCT-808 在侵襲性 BCL患者中的安全性和有效性。該研究包括兩個(gè)不同的階段：第一階段劑量遞增，第二階段劑量擴(kuò)大，目前正處于招募狀態(tài)。
3.3 雙特異性抗體
- NVG-111
NVG-111是一種NovalGen原研的人源化ROR1和CD3 BiTE，是由ROR1和CD3的scFv串聯(lián)而成的雙特異性抗體。NVG-111靶向ROR1陽(yáng)性的惡性細(xì)胞并利用T細(xì)胞固有的細(xì)胞毒作用，從而在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。臨床前研究表明，NVG-111在CLL和實(shí)體腫瘤中具有良好的T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。NovalGen在2023 ASH上公布了NVG-111的Phase I首次人體劑量遞增研究結(jié)果。公布的數(shù)據(jù)為T(mén)CE選擇性靶向ROR1提供了臨床概念驗(yàn)證，即使在已知T細(xì)胞功能缺陷的CLL患者中，也能獲得抗腫瘤活性的客觀證據(jù)，并具有反應(yīng)持久性。安全性與作用機(jī)制一致。
- EMB-07
EMB-07是由EpimAb 開(kāi)發(fā)的一種T細(xì)胞重定向雙特異性抗體，靶向ROR1和CD3。 EMB-07是基于EpimAb專有的 FIT-Ig（Fabs-In-Tandem 免疫球蛋白）技術(shù)進(jìn)行設(shè)計(jì)的雙特異性抗體。EMB-07與腫瘤細(xì)胞表面的TAA結(jié)合后，可以招募并激活表達(dá)CD3的T淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。在臨床前實(shí)驗(yàn)中，EMB-07顯示出極具潛力的療效和安全性。目前處于治療淋巴瘤的I期階段。
3.4 四特異性抗體
GNC-035是由Systimmune開(kāi)發(fā)的八價(jià)四特異性抗體，同時(shí)靶向PD-L1/CD3/4-1BB/ROR1,目前正處于臨床I期試驗(yàn)階段。Systimmune在2023 AACR公布了GNC-035臨床前結(jié)果表明，GNC-035具有介導(dǎo) ROR1+ 癌癥消退、克服基于TCR的免疫逃逸并逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞免疫抑制的潛力 [4]。
3.5 單克隆抗體藥物
Zilovertamab（以前稱為cirmtuzumab或UC-961)是Oncternal Therapeutics研發(fā)的靶向ROR1的單克隆抗體藥物，當(dāng)它與ROR1結(jié)合時(shí)，可阻斷WNT5A信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化。
Oncternal Therapeutics已對(duì) Zilovertamab 聯(lián)合Imbruvica治療MCL和慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）和邊緣區(qū)淋巴瘤 (MZL) 患者開(kāi)展1/2期臨床研究評(píng)估（NCT03088878）。此外，Zilovertamab還有兩項(xiàng)正在開(kāi)展的臨床試驗(yàn)，一項(xiàng)是Zilovertamab聯(lián)合Bcl-2 抑制劑Venetoclax治療R/R CLL的2期臨床試驗(yàn) (NCT04501939)；另一項(xiàng)是zilovertamab 聯(lián)合 docetaxel治療治療轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的1b期臨床試驗(yàn) (NCT05156905)。
2023年4月，Oncternal Therapeutics宣布根據(jù)Bruton酪氨酸激酶抑制劑（BTK 抑制劑）快速變化的商業(yè)格局進(jìn)行戰(zhàn)略優(yōu)先順序調(diào)整，zilovertamab與ibrutinib聯(lián)合的3期研究 ZILO-301和1/2期研究 CIRM-001* 將被關(guān)閉，以便將公司的現(xiàn)金跑道延長(zhǎng)至2025年，并將重點(diǎn)放在ONCT-808和ONCT-534的臨床開(kāi)發(fā)上。公司強(qiáng)調(diào)，該決定并非基于對(duì)齊洛維他單抗的安全性或有效性的任何擔(dān)憂。
4、締碼ROR1靶點(diǎn)產(chǎn)品助力新藥研發(fā)
締碼是一家專注于提供可成藥靶點(diǎn)臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務(wù)的生物技術(shù)公司，擁有創(chuàng)新型功能膜蛋白開(kāi)發(fā)、單B細(xì)胞先導(dǎo)抗體發(fā)現(xiàn)、抗體工程改造與功能驗(yàn)證平臺(tái)。締碼現(xiàn)可提供ROR1靶點(diǎn)全系列產(chǎn)品與服務(wù)，產(chǎn)品涵蓋多種屬活性蛋白、流式驗(yàn)證單抗及參照抗體。服務(wù)涵蓋人源化、親和力成熟、PTM風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)去除。另外，為了加速ROR1靶點(diǎn)藥物研發(fā)，締碼還針對(duì)ROR1制備了B細(xì)胞種子庫(kù)，最快20天可完成先導(dǎo)抗體分子篩選。
- 重組活性蛋白
Human ROR1 Protein, His Tag (PME100399)
Figure 3. Validation data of purified Human ROR1 Protein, His Tag (PME100399). Human ROR1 Protein, His Tag on SDS-PAGE (left); ROR1 Protein (PME100399) can bind Anti-ROR1 Neutralizing antibody (BME100073) in a linear range of 0.64-16 μg/ml (right).
- 重組兔單抗
Anti-ROR1 antibody(DM149); Rabbit mAb (DME100149)
Figure 4. Validation data of Anti-ROR1 antibody (DME100149); Human ROR1 protein (PME100399) can bind Rabbit anti-ROR1 monoclonal antibody (DME100149) in a linear range of 1-50 ng/ml (left); Flow cytometry analysis with Anti-ROR1 (DME100149) on HEK293 cells transfected with human ROR1 (Blue histogram) or HEK293 transfected with irrelevant protein (Red histogram), and Isotype antibody on HEK293 transfected with irrelevant protein (Orange histogram) (right).
- ELISA&FC驗(yàn)證參照抗體
Anti-ROR1(NBE 002 biosimilar) mAb (BME100191)
Figure 5. Validation data of Anti-ROR1(NBE 002 biosimilar) mAb (BME100191); Anti-ROR1(NBE 002 biosimilar) mAb (BME100191) can bind Anti-ROR1(NBE 002 biosimilar) mAb (BME100191) in a linear range of 0.64–16 ng/mL (left); Flow cytometry analysis with 1μg/mL Anti-ROR1(NBE 002 biosimilar) mAb (BME100191) on HEK293 cells transfected with Human ROR1 protein (Blue histogram) or HEK293 transfected with irrelevant protein (Red histogram),and isotype antibody on HEK293 transfected with irrelevant protein (Orange histogram) (right).
參考文獻(xiàn)：
[1] Zhao Yuming, Zhang Dengyang, Guo Yao et al. Tyrosine Kinase ROR1 as a Target for Anti-Cancer Therapies. [J] .Front Oncol, 2021, 11: 680834.
[2] Karvonen Hanna, Barker Harlan, Kaleva Laura et al. Molecular Mechanisms Associated with ROR1-Mediated Drug Resistance: Crosstalk with Hippo-YAP/TAZ and BMI-1 Pathways. [J] .Cells, 2019, 8: undefined.
[3] Spencer Park, Courtney Simianer, Sydney Spadinger, et al; Abstract 2754: LYL797, a ROR1 CAR T-cell therapy with genetic and epigenetic reprogramming for solid tumors. Cancer Res 15 June 2022; 82 (12_Supplement): 2754.
[4] Jahan Salar Khalili, et al; Abstract 5679: Tetra-specific antibody GNC-035: guidance and navigation control (GNC) molecule development for treatment of ROR1+ malignancies. Cancer Res 1 April 2023; 83 (7_Supplement): 5679.
