1986年，美國FDA批準了世界上首個單抗治療性藥物—Orthoclone（抗CD3單抗OKT3）進入市場，用于器官移植時的抗排斥反應，從此抗體藥的研發(fā)越來越受到青睞，使其逐漸成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥家族中的重要成員。截至2023年1月末，F(xiàn)DA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）已累計批準了119款治療性抗體新藥，而這個數(shù)字還在持續(xù)的增長。根據(jù)Precedence Research 姊妹公司 Towards Healthcare 發(fā)表的一項研究，預計到2028年，全球抗體藥市場收入將達到 4123.6 億美元左右，顯示出抗體藥物市場巨大的發(fā)展?jié)摿褪袌隹臻g。目前，單抗藥物的研發(fā)技術日益走向成熟，其中通過展示平臺實現(xiàn)文庫系統(tǒng)的表達和目標分子的篩選是單抗藥物研發(fā)過程中獲取高質量抗體分子的重要手段。抗體的展示平臺眾多，包括但不限于噬菌體展示、酵母菌展示、核糖體展示及哺乳動物細胞展示等等，其中哺乳動物細胞展示系統(tǒng)憑借獨特的優(yōu)勢，正在引起越來越多的重視。那么什么是哺乳動物細胞表面展示技術？與其他體外抗體文庫構建系統(tǒng)相比，它的優(yōu)勢體現(xiàn)在哪里？除了抗體分子篩選，是否還有其它方面的應用？本文將帶您了解相關內(nèi)容。

標志著哺乳動物細胞表面展示技術的成功建立是在2008年，Roger R. Beerli等人利用辛德畢斯（Sindbis）病毒表達系統(tǒng)構建了哺乳動物細胞表面展示抗體庫，并利用該展示文庫順利完成多個抗體的篩選。在該項研究中，研究者直接從志愿者的外周血單核細胞（PBMC）中分離具有特異性抗體的B細胞，獲得抗體的基因序列，利用重組DNA技術構建單鏈抗體cDNA庫（scFv），將其連接到高滴度的Sindbis病毒載體中，該載體中包含表達抗體的信號肽和能夠使抗體固定在膜上的跨膜區(qū)（TM）。通過載體病毒感染BHK細胞，在BHK細胞膜上展示抗體并進行篩選。該方法可以將抗體以完整IgG或Fab片段的形式展示抗體，并允許通過單次FACS分離特異性抗體，最終從陽性克隆中分離出的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列 [2]。這些技術的發(fā)展使得研究者們能夠更有效獲得具有特定功能的抗體，為藥物研發(fā)和臨床治療提供了更多的可能性。

2012年，Li等人以乙肝病毒特異性輕鏈抗體庫和重鏈抗體庫為基礎，通過哺乳動物細胞表面抗體展示技術構建二級抗體庫，成功篩選到乙肝病毒表面抗原特異性的抗體，這項研究為乙肝病毒的治療和預防提供了新的希望[2]。

哺乳動物細胞表面展示技術指的是應用重組DNA技術將待展示基因序列與哺乳動物細胞受體跨膜序列融合表達，利用受體跨膜區(qū)的膜定位作用將過表達的重組外源蛋白展示在哺乳動物細胞表面。以哺乳動物細胞抗體展示技術為例，該技術主要利用細胞表面表達抗體來篩選并獲取重組治療性單克隆抗體，步驟包含構建載體、轉染細胞、表達抗原表位及抗原識別。前兩步可以統(tǒng)稱為構建哺乳動物細胞表面展示抗體庫，最后一步又稱為與靶標特異性結合抗體的富集與篩選。在哺乳動物細胞展示技術中，以中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和人胚胎腎臟293（HEK293）細胞兩個哺乳動物表達系統(tǒng)應用最為廣泛。目前篩選出的適合這些表達系統(tǒng)的載體包括pcDNA系列載體、pDGB載體和部分病毒載體。

隨著細胞展示技術的發(fā)展, 細胞展示系統(tǒng)已從最初的原核展示系統(tǒng)擴展到真核展示系統(tǒng)。其中噬菌體展示系統(tǒng)是原核細胞展示系統(tǒng)的代表，也是最早開發(fā)、應用最廣泛的一類展示技術。酵母展示系統(tǒng)和哺乳動物細胞展示系統(tǒng)是真核展示系統(tǒng)的代表。每種展示系統(tǒng)都有各自的優(yōu)缺點。與其他展示系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞展示系統(tǒng)在抗體藥開發(fā)中具有顯著優(yōu)勢。它的表達系統(tǒng)與人體的最為相似，能夠指導蛋白翻譯后的正確折疊，提供復雜的翻譯后加工修飾，所以哺乳動物細胞展示技術表達的產(chǎn)物在分子結構和生物學功能方面更能接近于天然的高等生物蛋白分子。但是哺乳動物細胞的增殖速度較微生物慢，并且通過哺乳動物細胞展示平臺構建的展示庫容低于噬菌體或者酵母菌展示平臺，因此哺乳動物細胞展示平臺不適合于進行特別大通量的非免疫庫篩選。下表中對比了噬菌體展示系統(tǒng)與哺乳動物細胞展示系統(tǒng)的部分特性：

與哺乳動物細胞展示技術相比，利用噬菌體展示技術表達外源蛋白或多肽時，外源蛋白或多肽與衣殼蛋白融合表達時存在無法預測的偏差。此外，被展示的外源蛋白或多肽分子量不能太大，否則會影響噬菌體的裝配，從而降低它感染宿主的能力。

同為真核表達系統(tǒng)的酵母菌展示系統(tǒng)也存在一些限制。首先，酵母菌展示系統(tǒng)只能展示特定類型的外源蛋白，而不是任何外源蛋白都可以展示。此外，酵母菌在表達外源蛋白時存在過度糖基化的可能性，所以只能用來生產(chǎn)不含糖基化位點的功能性蛋白，限制了其應用范圍。而且，酵母菌表達系統(tǒng)中蛋白質后加工過程與哺乳動物細胞差異較大，不能像哺乳動物細胞表達系統(tǒng)那樣最大程度還原靶標蛋白的天然狀態(tài)。此外，酵母菌的遺傳穩(wěn)定性差，在傳代過程中容易丟失，從而造成難以重現(xiàn)的實驗結果。

由于哺乳動物細胞展示技術具有翻譯后修飾及表達糖蛋白的明顯優(yōu)勢，可有效解決原核細胞表達系統(tǒng)中出現(xiàn)的問題，它不僅能夠展示全長抗體，還能夠利用真核表達系統(tǒng)指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后修飾，通過該表達系統(tǒng)所合成的蛋白質在分子結構和生化特性方面與人類存具有極高的相似度。所以，哺乳動物細胞展示技術不僅可以應用于抗體藥物研發(fā)、多肽藥物研發(fā)等，還可以在疫苗研發(fā)、生物治療和診斷等領域中發(fā)揮作用。 除了抗體篩選，哺乳動物細胞表面展示技術還可以在其他許多方面應用。例如，它可以用于研究疾病的發(fā)生機制和信號通路，幫助科學家深入理解疾病的病理生理過程。此外，該技術還可以用于開發(fā)新型藥物靶點、疾病診斷標記物的鑒定和篩選等。 通過哺乳動物細胞表面展示技術構建和篩選重組治療性單克隆抗體的研究，為生物醫(yī)藥領域的進一步發(fā)展和創(chuàng)新提供了重要的平臺。對于疾病治療和藥物開發(fā)來說，這項技術的應用潛力巨大，將為人類健康帶來更多的福祉。

應用動物免疫開發(fā)治療性抗體是最為有效的方案，但是未經(jīng)改造的動物來源抗體不能用于臨床?？贵w人源化改造是抗體藥開發(fā)的必須階段。締碼生物致力于提供可成藥靶點臨床前研發(fā)產(chǎn)品和服務，旨在讓藥企跨過單抗平臺建立和先導抗體分子篩選的門檻，聚焦于藥靶生物學機制和可成藥性研究，加速臨床管線推進。為此，締碼生物科技搭建了基于哺乳動物細胞展示系統(tǒng)的抗體工程平臺（DiLibrary^TM），該平臺可用于抗體的深度人源化改造（人源化的同時實現(xiàn)親和力的提升）、抗體親和力成熟、納米抗體和TCR的工程改造，以及犬源化和貓源化等其他種源的抗體改造。

• 服務流程

• BCMA抗體深度人源化案例展示

采用締碼生物科技DiLibrary^TM人源化抗體庫進行篩選后，我們獲得了比母本嵌合抗體親和力更高的克隆。親和力提升到pM級別。

 

• CEACAM5抗體深度人源化案例展示

采用常規(guī)計算機輔助設計進行人源化，CEACAM5抗體親和力完全丟失；采用締碼生物科技DiLibrary^TM人源化抗體庫進行篩選后，獲得比嵌合抗體親和力更高的克隆。

• CCR8抗體親和力成熟案例展示

   

該案例中的anti-CCR8抗體具有人猴交叉屬性，針對該分子的LCDR3和HCDR3各突變一個氨基酸，即特異性地將對人源CCR8的親和力提高了約100倍，而不影響對猴源CCR8的親和力。

此外，作為一個專業(yè)聚焦于抗體藥臨床前開發(fā)公司，締碼生物在開發(fā)高質量先導分子的上下游進行了深度布局。為了獲得高質量最為天然構象的多穿膜蛋白抗體，我們還搭建了基于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的多穿膜蛋白抗原制備平臺（DiMPro），該平臺充分利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)優(yōu)勢，可制備生產(chǎn)全長功能性多穿膜蛋白，最大程度的保證重組蛋白的天然構象，點擊查看更多詳情>>

 

參考文獻：

【1】Beerli RR, Bauer M, Buser RB, Gwerder M, Muntwiler S, Maurer P, Saudan P, Bachmann MF. Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 23;105(38):14336-41.

【2】Li CZ, Liang ZK,Chen ZR,et al. Identification of HBsAg-specificantibodies from a mammalian cell displayed full-length humanantibody library of healthy immunized donor [J]. Cell MolImmunol, 2012,9(2):184-90.